李 夫， 夏鵬飛， 戴雪辰， 石 康， 熊 鷹， 劉映樂

(武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 病毒學(xué)國家重點實驗室， 武漢 430072)

人源FCHo1蛋白μHD結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、純化及晶體生長

李 夫， 夏鵬飛， 戴雪辰， 石 康， 熊 鷹， 劉映樂

(武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 病毒學(xué)國家重點實驗室， 武漢 430072)

人FCHo1 蛋白(Fer/Cip4 homology domain only proteins 1)是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑中的成核劑，其碳端μHD結(jié)構(gòu)域(AP2-μ homology domain)對于FCHo1在披網(wǎng)格蛋白小泡(clathrin-coated vesicle)形成過程中的正確定位非常重要。為揭示人FCHo1碳端μHD結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)制，制備可衍射的μHD結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)晶體并解析其結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。通過構(gòu)建pET15b原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)。利用親和層析、離子交換層析和分子篩層析技術(shù)，制備得到純度95%以上的蛋白。通過多次優(yōu)化結(jié)晶條件，獲得衍射率約2.1 ?的μHD結(jié)構(gòu)域蛋白晶體，為解析其晶體結(jié)構(gòu)奠定了良好的基礎(chǔ)。

FCHo1；μHD結(jié)構(gòu)域；表達(dá)；純化；結(jié)晶；衍射

網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是目前研究得較為清楚的內(nèi)吞途徑之一，也是大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)吞作用的主要途徑[1]。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑在神經(jīng)介質(zhì)傳遞、信號傳導(dǎo)、病原體入侵和細(xì)胞質(zhì)膜活動等的調(diào)控中起重要作用，對于高等真核生物的正常生理活動十分必要[2]。網(wǎng)格蛋白主要通過包被細(xì)胞質(zhì)膜形成披網(wǎng)格蛋白小泡發(fā)揮作用，最終將胞外大分子胞吞[3-4]。其中，包被小窩的形成主要依賴于FCHo1/2 (Fer/Cip4 homology domain only proteins 1 and 2)、Eps l5 (EGFR pathway substrate 15)和交叉蛋白-1 (intersectin-1)組成的蛋白復(fù)合體參與[5]。FCHo1蛋白是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑中的成核劑，對披網(wǎng)格蛋白小泡的成形和出芽極其重要，其表達(dá)水平的高低直接影響披網(wǎng)格蛋白小泡出芽，配體內(nèi)吞以及支架蛋白的招募[6]，也能輔助BMP(bone morphogenetic protein)受體在原腸胚的形成過程中發(fā)揮功能[7]。人源FCHo1蛋白碳端μHD結(jié)構(gòu)域(圖1)在酵母和人中的功能是保守的，其與適配/支架蛋白(Ede1/eps15)的相互作用對于FCHo1蛋白在內(nèi)吞途徑中的正確定位至關(guān)重要[8-9]。同時，μHD結(jié)構(gòu)域能與Dab2、Intersectin、Hrb等多種蛋白相互作用，和銜接蛋白AP2(adapter protein 2)附屬物結(jié)構(gòu)域一樣[10-11]，形成網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑的互作中心[12]。目前，關(guān)于FCHo1蛋白μHD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)尚不清楚，其發(fā)揮功能的具體機(jī)制仍需更深入的研究。X射線衍射仍是當(dāng)今最為有效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)之一，本研究通過構(gòu)建人源FCHo1蛋白碳端μHD結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化得到高純度蛋白，并篩選出蛋白晶體，通過多次優(yōu)化結(jié)晶條件，收集衍射率約2.1 ?的衍射數(shù)據(jù)，為解析μHD結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)和揭示其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

圖1 人FCHo1蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖[6]

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株BL21(DE3)和表達(dá)載體pET15b(Novagen)。PCR引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成，基因測序由北京擎科新業(yè)公司完成。限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自Thermo公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司，DNA Marker 購自全式金公司，Pfu聚合酶為實驗室制備。Ni-NTA Agarose為QIAGEN公司產(chǎn)品；陰離子交換柱Source 15Q，分子篩Superdex-200 10/30和蛋白純化系統(tǒng)AKTA均為GE Healthcare公司產(chǎn)品。晶體篩選試劑盒購自Hampton Research 公司，化學(xué)試劑購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1μHD產(chǎn)物擴(kuò)增及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫NP_001154829.1：合成人源FCHo1蛋白碳端cDNA基因序列。設(shè)計μHD(622-891)上游擴(kuò)增引物：5′-CGCATATGAGCCAAGATGCGTTACCGATTGCGACCG-3′(含NdeⅠ酶切位點)。由于Cys側(cè)鏈巰基易氧化，因此將第889位Cys突變成Ser以降低蛋白被氧化程度，增加蛋白質(zhì)的均一性，設(shè)計下游擴(kuò)增/突變引物：5′-GCCCTCGAGTTACCAGGTGCTGCCTTGCGG-3′(含XhoⅠ酶切位點)。采用高保真Pfu DNA聚合酶PCR擴(kuò)增目的基因片段，T4連接酶連接NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后的片段和載體，18℃，2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂于1 mmol/L氨芐抗性的LB平板，菌液PCR篩選陽性單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序。

1.2.2 μHD重組蛋白原核表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至10 mL 1 mmol /L氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌按1∶100比例接入1L LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，待菌液D600 nm光密度值為0.8～1.0，加入終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，降溫至16℃，誘導(dǎo)過夜。

1.2.3 μHD重組蛋白純化

離心收集菌體，用裂解緩沖液(pH值8.0)重懸，高壓破碎細(xì)胞。將細(xì)胞破碎物4℃，14 000 r/min離心45 min，取上清轉(zhuǎn)移至鎳柱，經(jīng)鎳柱親和層析和離子交換層析后，取離子交換圖譜出峰位置對應(yīng)管號的蛋白洗脫樣品，SDS-PAGE電泳檢測其大小和純度。收集目的蛋白，并使用限制性蛋白酶切His標(biāo)簽。將切除標(biāo)簽后的蛋白濃縮，上樣至分子篩層析柱進(jìn)一步純化，280 nm紫外波長檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳檢測分子篩蛋白洗脫樣品濃度和純度，將濃度和純度均達(dá)到結(jié)晶要求的對應(yīng)管號蛋白濃縮，分裝，液氮速凍，-80℃保存。

1.2.4 μHD晶體生長條件初篩和優(yōu)化

采用坐滴氣相擴(kuò)散法在18℃進(jìn)行晶體生長條件初篩。使用Hampton公司的Index，Crystal Screen，SaltRx和PEG/Ion 4種試劑盒，蛋白與試劑按1∶1比例混合。根據(jù)初篩出晶條件，采用懸滴氣相擴(kuò)散法優(yōu)化結(jié)晶條件。

2 結(jié)果

2.1μHD原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

表達(dá)載體pET15b N端帶有6×His標(biāo)簽序列，標(biāo)簽與外源片段之間含限制性蛋白酶切位點，用于切除蛋白標(biāo)簽。雙酶切后的載體與外源片段使用T4連接酶連接。使用菌液PCR篩選μHD重組質(zhì)粒陽性單克隆，目的條帶大小與陽性對照大小一致(圖2)，經(jīng)測序和比對正確，成功構(gòu)建μHD原核表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 μHD重組蛋白表達(dá)及鎳柱親和層析純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，16℃，0.2 mmol/L IPTG過夜誘導(dǎo)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，目的蛋白大量表達(dá)，洗脫液樣品泳道約33.5 ku處出現(xiàn)明顯條帶，與帶標(biāo)簽的目的蛋白分子量大小符合(圖3)。目的蛋白帶有His標(biāo)簽，能緊密結(jié)合鎳柱，而不帶His標(biāo)簽的雜蛋白不結(jié)合或只能微弱結(jié)合。咪唑基團(tuán)與目的蛋白競爭性結(jié)合鎳離子。經(jīng)多次優(yōu)化，使用15 mmol/L濃度咪唑洗滌液能除去大量雜蛋白的同時盡量保留目的蛋白，可用含250 mmol/L高濃度咪唑的洗脫緩沖液將目的蛋白從鎳柱上洗脫。

圖2 μHD重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定

泳道1—μHD重組表達(dá)質(zhì)粒菌液PCR條帶；泳道2—陽性對照；泳道3—陰性對照；泳道M—DNA marker。

圖3 μHD重組蛋白SDS-PAGE電泳檢測

泳道M—蛋白marker；泳道1—菌體破碎后的沉淀；泳道2—菌體破碎后的上清；泳道3—鎳柱上樣流穿液；泳道4—含15 mmol/L咪唑雜蛋白洗滌緩沖液經(jīng)鎳柱后的洗脫液；泳道5—含250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

2.3 離子交換和分子篩層析純化

利用蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)差異，使用離子交換層析對蛋白進(jìn)一步純化。將從鎳柱洗脫下的目的蛋白上樣至Source 15Q陰離子交換柱。目的蛋白在電導(dǎo)率為13.4 mS/cm處呈現(xiàn)較高的單峰，其他雜蛋白不結(jié)合柱子或在其他電導(dǎo)率范圍被洗脫(圖4A)。SDS-PAGE電泳檢測，收集出峰位置對應(yīng)管號的蛋白切除標(biāo)簽，濃縮。使用分子篩Superdex-200 10/30進(jìn)一步純化目的蛋白。分子篩結(jié)果顯示，出峰位置對應(yīng)樣品分子量大小與目的蛋白一致，紫外吸收峰值高，峰型對稱且無拖尾現(xiàn)象，說明蛋白樣品濃度高且性質(zhì)均一(圖4B)。收集出峰位置對應(yīng)管號蛋白，SDS-PAGE電泳檢測純度達(dá)到95%以上。

圖4 μHD重組蛋白離子交換(A)和分子篩(B)層析純化

2.4 μHD晶體生長條件初篩、優(yōu)化及衍射

蛋白與試劑按1∶1比例混合，18℃長晶體，2 d后觀察細(xì)小晶體長出(圖5A)。對結(jié)晶緩沖液pH值和沉淀劑濃度等進(jìn)行多次優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L 檸檬酸，0.1 mol/L Bis-Tris-丙烷，pH值4.0，5%(w/v)聚乙二醇3350為晶體適宜生長條件，該條件下長出的晶體為體積較大的長棍形晶體(圖5B)。優(yōu)化的蛋白晶體同步輻射光源衍射分辨率達(dá)到約2.1 ?(圖5C)，并收集一套完整數(shù)據(jù)。

圖5初篩(A)和優(yōu)化后(B)的μHD蛋白晶體及其衍射圖(C)

3 討論

已知與人FCHo1蛋白同源的酵母Syp1蛋白μHD結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)已解。目前，尚無人源FCHo1蛋白碳端μHD結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。為解析人源μHD結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，制備高分辨率的蛋白晶體非常重要。

人源μHD長849 bp，編碼283個氨基酸，預(yù)測等電點為6.6，相對分子質(zhì)量約為30.6 ku。針對μHD結(jié)構(gòu)域蛋白難于結(jié)晶的問題，我們設(shè)計了一系列μHD蛋白截短體均未能獲得可溶性蛋白或晶體，僅622～891截短體不影響蛋白可溶性表達(dá)且能結(jié)晶，說明其氮端前13個氨基酸會影響晶體的形成。μHD(622～891)蛋白含3個Cys，由于Cys側(cè)鏈巰基易氧化，導(dǎo)致蛋白性質(zhì)不均一，因此分別將第647、761和889位Cys突變成Ser，發(fā)現(xiàn)647和761位Cys突變后蛋白出現(xiàn)不溶，說明647和761位的Cys對其正確折疊是必需的。因此，僅將第889位Cys氨基酸突變?yōu)镾er，使蛋白性質(zhì)更加均一。目的蛋白N端連接6×His標(biāo)簽，便于利用鎳柱親和層析純化，提高了純化效率，再經(jīng)后續(xù)離子交換和分子篩層析純化，蛋白純度達(dá)到95%以上。

本研究通過構(gòu)建μHD原核表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)，經(jīng)親和層析、離子交換和分子篩層析，獲得了濃度、純度和均一性均達(dá)到結(jié)晶要求的FCHo1 μHD結(jié)構(gòu)域蛋白，并篩選出晶體。多次優(yōu)化結(jié)晶條件后，獲得分辨率約2.1 ?的高分辨率蛋白晶體，為解析人源FCHo1 μHD結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Expression, purification and crystallization ofHumanFCHo1 μHD domain

LI Fu, XIA Peng-fei, DAI Xue-chen, SHI Kang, XIONG Ying, LIU Ying-le

(State Key Laboratory of Virology, College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

The human FCHo1 protein (Fer/Cip4 homology domain only proteins 1) is nucleator of clathrin-mediated endocytosis and its C terminal μHD domain (AP2-μ homology domain) is critical to the correct positioning of FCHo1 in the formation of clathrin-coated vesicles of clathrin-mediated endocytosis. To determine the crystal structure and understand the structural mechanism of human FCHo1 μHD domain，it is essential to obtain high resolution protein crystal which can be analyzed by X-Ray. The human FCHo1μHDwas cloned into the expression vector pET15b and verified by bacteria liquid PCR and gene sequencing. Proteins were overexpressed inE.coliBL21 (DE3) which induced by 0.2 mmol/L IPTG at 16℃ overnight. The recombined proteins were purified by Ni-affinity chromatography (Ni-NTA), ion exchange chromatography (IEC) and size exclusion chromatography (SEC), respectively. Proteins were detected by SDS-PAGE and the purity was over 95%. Crystal screen kits from Hampton Research were applied to the preliminary screening of μHD protein by setting-drop method. The human FCHo1 μHD protein crystal at about 2.1 ? resolution was acquired after optimizing the condition of crystallization by hanging-drop vapor-diffusion method and data were collected in Shanghai synchrotron radiation facility (SSRF). This study has built a good foundation for determining the crystal structure of human FCHo1 μHD domain.

FCHo1; μHD domain; expression; purification; crystallization; diffraction

2015-02-03；

2015-02-15

國家“973計劃”項目(No. 2011CB504900)

李 夫，碩士研究生，專業(yè)方向為分子病毒學(xué)；

劉映樂，副教授，主要研究方向為分子病毒學(xué)，E-mail：mvlwu@whu.edu.cn。

Q786

A

2095-1736(2015)05-0007-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.007