盧庭婷

（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)系，廣西 南寧 530021）

丹參酮抑制鈣調(diào)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在心肌梗死后惡性心律失常中的作用＊

盧庭婷

（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)系，廣西 南寧 530021）

目的觀察丹參酮對(duì)心肌梗死家兔模型惡性心律失常的作用，并探討丹參酮導(dǎo)致的鈣調(diào)蛋白（CaM）信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)改變與惡性心律失常發(fā)生率降低之間的關(guān)系。方法選取健康大耳家兔共90只，隨機(jī)分為3組：心肌梗死模型家兔（無干預(yù)組）、心肌梗死丹參酮干預(yù)家兔（干預(yù)組）和假手術(shù)對(duì)照家兔（對(duì)照組），每組30只。對(duì)3組家兔惡性心律失常發(fā)生率、CaM、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMK－Ⅱ）活性、跨室壁復(fù)極離散度（TDR）、心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并比較。結(jié)果對(duì)照組未發(fā)生惡性心肌梗死，無干預(yù)組和干預(yù)組惡性心律失常發(fā)生率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；無干預(yù)組惡性心律失常率（60.0%）高于干預(yù)組（10.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。無干預(yù)組和干預(yù)組家兔的CaM蛋白水平分別是對(duì)照組家兔的1.483倍和1.321倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；無干預(yù)組家兔CaM蛋白水平高于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組間CaMKⅡ的活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。無干預(yù)組血清鈣離子水平高于對(duì)照組和干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組低于無干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組TDR低于無干預(yù)組，這兩組TDR均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組梗死心肌單細(xì)胞水平胞內(nèi)鈣濃度低于無干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CaM信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的相關(guān)信號(hào)因子的水平對(duì)心肌梗死后惡性心律失常有提示作用。丹參酮可以通過抑制CaM信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)而在預(yù)防心肌梗死后惡性心律失常中發(fā)揮重要作用。

鈣調(diào)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)； 丹參酮； 心肌梗死； 惡性心律失常

鈣調(diào)蛋白（CaM）是一種導(dǎo)致心律失常的信號(hào)分子，可以作為預(yù)防心肌梗死后惡性心律失常藥物的作用靶點(diǎn)。而丹參酮是治療心肌缺血的傳統(tǒng)藥物，具有抑制CaM表達(dá)和減少鈣內(nèi)流的特性［1］。本研究從在體心臟、離體心臟和心肌條塊等不同層面結(jié)合電生理和分子生物學(xué)技術(shù)，旨在探討心肌梗死后心肌細(xì)胞CaM活性與惡性心律失常發(fā)生之間的關(guān)系，以及丹參酮抑制該靶點(diǎn)對(duì)減少心肌梗死后惡性心律失常發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 90只健康長耳大白兔購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，采用數(shù)字隨機(jī)表法分為3組（每組30只）：（1）心肌梗死模型組（無干預(yù)組），體質(zhì)量為（4.2±0.5）kg，雌兔14只、雄兔16只；（2）心肌梗死丹參酮干預(yù)組（干預(yù)組），體質(zhì)量為（4.3±0.5）kg，雌兔15只，雄兔15只；（3）假手術(shù)對(duì)照組（對(duì)照組），體質(zhì)量為（4.3±0.6）kg，雌兔15只，雄兔15只。3組家兔的體質(zhì)量、雌雄比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型的制作 按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組，分別對(duì)3組家兔進(jìn)行不同處理。無干預(yù)組和干預(yù)組家兔予以開胸并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支，建立心肌梗死模型；對(duì)照組只開胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支。

1.2.2 體內(nèi)研究 以雙極電極基礎(chǔ)步長為1 000ms，刺激起搏心肌塊心內(nèi)膜，心肌塊連續(xù)起搏直至電生理穩(wěn)定后（通常穩(wěn)定1h），干預(yù)組灌流含30g/mL丹參酮ⅡA磺酸鈉的臺(tái)式液預(yù)處理30min，無干預(yù)組灌流臺(tái)式液30min。隨后，無干預(yù)組和干預(yù)組停灌30min造成心肌缺血，此時(shí)程序性刺激誘發(fā)室性心率失常，給予刺激的強(qiáng)度為2倍舒張期閾值，刺激信號(hào)的脈寬為1ms。停灌40min后，無干預(yù)組復(fù)灌臺(tái)式液，干預(yù)組復(fù)灌含30g/mL丹參酮ⅡA磺酸鈉的臺(tái)式液，而對(duì)照組持續(xù)灌流臺(tái)式液，對(duì)照組與干預(yù)、無干預(yù)兩組在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行程序性誘發(fā)室性心率失常。利用長程心電圖技術(shù)記錄急性心肌梗死后惡性心律失常的發(fā)生情況，同期應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)測定CaM鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的活性。測定流程為：將樣品和反應(yīng)液充分反應(yīng)，再在1mmol/L CaCl2、10μg/mL CaM存在的條件下測定；非Ca2＋依賴性活性在5mmol/LCa2＋螯合劑EGTA存在的環(huán)境下測定；混合液于30℃孵育5min，取20μL反應(yīng)液滴至濾膜上，用磷酸洗3次，晾干濾紙，采用液閃儀測定放射性活性。

1.2.3 心肌組織塊水平的研究 建立兔心肌梗死心肌楔形塊的灌流模型，采用浮置玻璃電極法同步記錄跨室壁復(fù)極離散度（TDR），熒光探針Fura－2/AM負(fù)載/共聚焦顯微鏡測定跨室壁三層心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化。

1.2.4 單細(xì)胞水平研究 使用酶解法分別獲得心肌梗死后兔左心室，采用單細(xì)胞RT－PCR膜片鉗技術(shù)、膜片鉗結(jié)合熒光跟蹤細(xì)胞內(nèi)鈣技術(shù)，測定梗死心肌單細(xì)胞水平胞內(nèi)鈣濃度變化。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)3組家兔發(fā)生惡性心律失常率、CaM、CaMKⅡ的活性、TDR、心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均值的組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組家兔心肌梗死后誘發(fā)惡性心律失常發(fā)生率比較 對(duì)照組無惡性心肌梗死發(fā)生，無干預(yù)組和干預(yù)組惡性心律失常發(fā)生率分別為60.0%（18/30）和10.0%（3/30），均高于對(duì)照組（P＜0.05），無干預(yù)組高于干預(yù)組（P＜0.05）。

2.2 3組家兔CaM水平、CaMKⅡ活性及Ca2＋濃度的比較以對(duì)照組CaM水平為內(nèi)參，測得無干預(yù)組和干預(yù)組CaM水平分別是對(duì)照組的1.483倍和1.321倍，無干預(yù)組CaM水平高于干預(yù)組（P＜0.05）。3組家兔CaMKⅡ的活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。無干預(yù)組家兔血清Ca2＋濃度高于對(duì)照組和干預(yù)組，干預(yù)組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 3組家兔TDR及梗死心肌單細(xì)胞Ca2＋濃度的比較 干預(yù)組TDR低于無干預(yù)組，且這兩組TDR均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組梗死心肌單細(xì)胞水平胞內(nèi)Ca2＋濃度低于無干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

心肌梗死后發(fā)生惡性心律失常往往是導(dǎo)致心肌梗死患者死亡的重要原因之一。惡性心律失常疾病本身具有較高的猝死危險(xiǎn)性。惡性心律失常患者均伴隨著心臟的器質(zhì)性病變。該病發(fā)病急，患者常呈危象，目前臨床尚無有效的手段對(duì)惡性心律失?；颊哌M(jìn)行有效治療［2］。惡性心律失常其發(fā)生的機(jī)制目前尚無明確結(jié)論，就目前的研究數(shù)據(jù)顯示，惡性心律失常涉及的機(jī)制較多，其中鈣超載機(jī)制是所有研究均認(rèn)可的一種，因此鈣超載被大家所認(rèn)可［3－4］。心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋超載使得多種胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)被激活，蛋白磷酸化和去磷酸化系統(tǒng)的激活導(dǎo)致分子信號(hào)調(diào)節(jié)共同通路打開，從而使多種機(jī)制參與到對(duì)心肌離子通道的調(diào)節(jié)中來，因此，蛋白磷酸化是絕大多數(shù)心肌離子通道調(diào)節(jié)的主要方式和共同途徑［5］。鈣超載后心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、離子通道發(fā)生異質(zhì)性改變，而對(duì)離子通道產(chǎn)生抑制作用，抑制內(nèi)向Ca2＋電流，但缺血能增加外向K＋電流，因此引起心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極至90%的時(shí)間（APD90）縮短，心外膜心肌細(xì)胞的APD90縮短更為明顯，從而使缺血性心肌TDR明顯增大，易產(chǎn)生折返環(huán)和促發(fā)活動(dòng)，為心律失常的發(fā)生提供了基礎(chǔ)［6－7］。

丹參酮是中藥丹參的主要有效成分，丹參對(duì)改善心腦血管循環(huán)具有確切的療效，臨床大量使用丹參制成的各種中成藥治療心腦血管疾病，最為廣泛應(yīng)用的是丹參注射液、香丹注射液、丹參滴丸等［8］。葉勇等［9］研究了丹參酮對(duì)CaM血管生成影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，丹參酮可促進(jìn)CaM血管增生，具有一定的促血管新生作用。

本研究從在體、心肌組織塊、離體心肌單細(xì)胞水平三個(gè)角度分析了CaM傳導(dǎo)系統(tǒng)在心肌梗死后惡性心律失常發(fā)生中的作用，結(jié)果表明，無干預(yù)組和干預(yù)組家兔的CaM蛋白水平分別是對(duì)照組的1.483倍和1.321倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），無干預(yù)組CaM水平高于干預(yù)組（P＜0.05）；無干預(yù)組血清Ca2＋水平高于對(duì)照組和干預(yù)組（P＜0.05），對(duì)照組低于干預(yù)組（P＜0.05）；干預(yù)組TDR低于無干預(yù)組家兔，兩者TDR均高于對(duì)照組（P＜0.05）；干預(yù)組梗死心肌單細(xì)胞水平胞內(nèi)鈣濃度低于無干預(yù)組（P＜0.05），說明CaM可作為預(yù)防心肌梗死后惡性心律失常新靶點(diǎn)。丹參酮以CaM信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)為靶點(diǎn)，可有效預(yù)防心肌梗死后惡性心律失常的發(fā)生，為開發(fā)傳統(tǒng)中藥的新用途和減少心肌梗死后心律失常的發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)［10］。

綜上所述，CaM信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中信號(hào)因子的改變對(duì)心肌梗死后惡性心律失常有提示作用。丹參酮可以通過抑制CaM信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，在預(yù)防心肌梗死后惡性心律失常中發(fā)揮重要作用。

［1］ 王文廣，張存泰，吳杰，等.鈣調(diào)蛋白抑制劑對(duì)陳舊性心肌梗死兔室性心律失常的影響［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2005，19（1）：60－62.

［2］ 肖志超，張存泰，馬業(yè)新，等.厄貝沙坦對(duì)兔肥厚心肌鈣調(diào)蛋白激酶活性及室性心律失常發(fā)生的影響［J］.臨床心血管病雜志，2006，22（8）：478－480.

［3］ 王文廣，吳杰，張存泰，等.心肌缺血時(shí)鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的變化與對(duì)心臟的影響［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2005，19（4）：313－315.

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The effects of tanshinone inhibiting calmodulin signal system on malignant arrhythmias after myocardial infarction＊

Lu Tingting
（In spection Department，Guangxi Medical College，Nanning，Guangxi 530021，China）

ObjectiveTo observe the effects of tanshinone on malignant arrhythmias which occured in rabbit model of myocardial infarction，and explore the relationship between tanshinone induced calmodulin（CaM）signal system changes and the incidence of malignant arrhythmias after myocardial infarction.MethodsA total of 90healthy big ear rabbits were selected and randomly divided into 3groups：myocardial infarction model rabbits（non－intervention group）and myocardial infarction model rabbits with tanshinone intervention（intervention group）and sham operated rabbits（control group），30rats in each group.The incidence of malignant arrhythmias，calmodulin（CaM），calmodulin kinaseⅡ（CaMKⅡ），transmural dispersity of repolarization（TDR）and the concentration of Ca2＋in myocardial cells were statistically analysed and compared among the 3groups.ResultsThe control group did not undergo malignant myocardial infarction，in non－intervention group and intervention group，malignant arrhythmia incidence was higher than that in control group（P＜0.05）；in non－intervention group，malignant arrhythmia rate（60.00%）was higher than that in intervention group（10%）（P＜0.05）.The CaM concentration in non－intervention and intervention group rabbits were 1.483and 1.321times of control group rabbits respectively，the difference was statistically significant（P＜0.05）；CaM protein levels of nonintervention group was higher than that of intervention group（P＜0.05）.No statistical significance of CaMKⅡactivity among the 3groups were observed（P＞0.05）.Serum Ca2＋concentration in non－intervention group was higher than that in control group and intervention group（P＜0.05）；serum Ca2＋concentration in control group was lower than that in intervention group（P＜0.05）.The TDR of intervention group is lower than that of non－intervention group，the two groups′TDR were both higher than that of control group（P＜0.05）.At single cell level，the intracellular calcium concentration of intervention group was lower than that of non－intervention group（P＜0.05）.ConclusionThe relevant signal factors of CaM signal transduction system have implications on malignant arrhythmia after myocardial infarction.Tanshinone can inhibit CaM signaling system and play an important role in the prevention of malignant arrhythmia after myocardial infarction.

calmodulin signal system； tanshinone； myocardial infarction； malignant arrhythmia

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.029

A

1673－4130（2015）03－0355－03

2014－12－10）

廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院項(xiàng)目（WZ2014JA08）。 作者簡介：盧庭婷，女，講師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究。