李洪枚

摘要：研究用辣根過氧化物酶（HRP）催化氧化法處理水中己烯雌酚（DES）的適宜工藝反應(yīng)條件。試驗考察了反應(yīng)溫度、pH和反應(yīng)物反應(yīng)計量比等對DES去除率的影響。結(jié)果顯示，在pH4.5、25 ℃、[HRP]0/[DES]0為1.000 U/μmol和MH■O■∶MDES（反應(yīng)摩爾比）為1∶2的反應(yīng)條件下，反應(yīng)3 h，DES去除率可達到92.08%。研究表明，HRP催化H2O2氧化DES反應(yīng)的適宜條件是：pH4.5左右，溫度25 ℃左右，[HRP]0/[DES]0為1.000 U/μmol，MH■O■：MDES宜大于0.5;過量H2O2抑制HRP催化活性;DES起始濃度越高，其去除速率越大;以底物DES去除速率表示的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為74.63 mmol/（L·h）和46.75 mmol/L。

關(guān)鍵詞：酶催化氧化;處理;己烯雌酚

中圖分類號：X131;TQ426.97 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0331-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.019

Enzyme-Catalyzed Oxidation of Diethylibestrol in Aqueous Phase

LI Hong-mei

（School of Safety and Environmental Engineering， Capital University of Economics and Business， Beijing 100070， China）

Abstract： Conditions for the horseradish peroxidase （HRP） catalyzed oxidation of diethylibestrol （DES） in aqueous phase were studied. The effects of pH， reaction temperature and mole ratio of reactants on the removal of DES were determined. 92.08% of DES was oxidized under the condition of pH4.5， 25 ℃， 1.000 U/μmol ratio of HRP to DES，MH■O■∶MDES （mole ratio） =1∶2 and reaction time of 3 h. The optimal conditions for the oxidation of DES catalyzed by HRP were pH 4.5， 25 ℃，1.000 U/μmol ratio of HRP to DES and more than 0.5 mole ratio of MH■O■：MDES. Overdose of H2O2 inhibited the catalization activity of HRP. With the increase of initial concentration of DES， reaction rate was increased. The maximum rate （Vmax） and Michaelis constant （Km） of enzyme were 74.63 mmol/（L·h） and 46.75 mmol/L， respectively. The reaction rate was expressed in terms of DES removal per hour.

Key words： enzyme-catalyzed oxidation; disposal; diethylibestrol

己烯雌酚（diethylibestrol，DES）是一種人工合成的藥用非甾體雌激素，與天然雌激素雌二醇有相同的功效，主要用于治療雌激素低下癥等疾病，部分女性保健品和化妝品中也含有一定量的DES[1]。DES是一種生物活性很強的環(huán)境激素，水體中微量DES可誘導(dǎo)雄魚體內(nèi)卵黃蛋白原明顯升高，具有很強的內(nèi)分泌干擾能力[2]。有研究顯示孕婦吸收DES，其男孫代出現(xiàn)尿道下裂幾率高[3]。DES還可引起基因突變而誘發(fā)癌癥[4-6]，長期食用含微量DES的食品可導(dǎo)致兒童性早熟、男性精子畸形和雌性化等危害[7，8]。因此，國內(nèi)外對DES作為藥物使用進行了嚴格限制，尤其是禁止將DES用作飼料添加劑[9]。遺憾的是，我國部分畜禽養(yǎng)殖企業(yè)為提高畜禽產(chǎn)量，違法在飼料中添加DES，導(dǎo)致禽蛋和肉類食品中DES殘留量高達0.2～10.0 mg/kg，存在極大的健康隱患[10，11]。環(huán)境中的DES主要來自藥品生產(chǎn)企業(yè)、醫(yī)院、養(yǎng)殖企業(yè)和居民生活等產(chǎn)生的污水[12]， 報道顯示我國部分地區(qū)地表水中DES的濃度達到6 ng/L[13]，部分城市的污水處理廠出水中DES的濃度為0.3～6.2 ng/L[14，15]。西班牙有關(guān)污水處理廠排出水中DES濃度為34 ng/L[16]?？梢?，現(xiàn)有污水處理工藝還不能有效去除水中DES。而國內(nèi)外僅有幾篇用光催化氧化法處理水體中DES的研究報道[17-21]， 相關(guān)研究很少。酶催化氧化處理廢水中有機污染物以其反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)快和選擇性好等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注，本研究選用辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）催化H2O2氧化水中微量DES，試驗考察反應(yīng)溫度、pH、H2O2和DES初始濃度等反應(yīng)條件對HRP催化氧化DES過程的影響，得到適宜的反應(yīng)工藝參數(shù)，為進一步建立HRP處理實踐中含DES廢水新技術(shù)提供依據(jù)。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器與試劑

Agilgent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）， 色譜柱為Beckman Ultrasphere ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Cary 50型紫外可見分光光度計（美國瓦里安公司），LY-1000型恒溫培養(yǎng)振蕩器（江蘇金壇市億通電子有限公司），PHS-3C型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SKY-100C型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海蘇坤實業(yè)有限公司），單道可調(diào)式移液器（德國Eppendorf公司，兩種規(guī)格：10～200 μL和100～1 000 μL），F(xiàn)A2004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），10 mL帶有刻度的棕色避光瓶。

試驗用試劑從Sigma-Aldrich公司購買，包括色譜純試劑己烯雌酚、甲醇、乙腈和2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS），分析純試劑雙氧水（30%H2O2）、磷酸二氫鉀、正磷酸（85%H3PO4）、冰乙酸、硼酸、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、氫氧化鉀和氫氧化鈉，生化試劑辣根過氧化物酶（HRP，250～330 U/mg）、過氧化氫酶（2 000～5 000 U/mg）和牛血清白蛋白（純度大于98%），去離子水（Hitech-Sciencetool超純水系統(tǒng)制備）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?溶液的配制 ?DES標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱量2.5 mg DES，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容備用（注：DES在水中幾乎不溶，故用甲醇配制），濃度為0.093 27 mmol/L。考慮到酶促反應(yīng)速度快及其與工業(yè)廢水中DES濃度的相近程度，本試驗采用DES初始濃度為0.037 3 mmol/L。

HRP溶液：準(zhǔn)確稱取1 mg HRP溶于250 mL去離子水中，再用單道可調(diào)式移液器移取1 mL HRP溶液于100 mL容量瓶中用去離子水定容，測得其活性為0.624 8 U/mL，置于4 ℃避光條件下保存待用， 保存時間不超過1周。

H2O2溶液：含30%H2O2的雙氧水，密度為1.122 g/cm3。取1 mL雙氧水于100 mL容量瓶中用去離子水定容，再從100 mL H2O2溶液中取1 mL于50 mL容量瓶中定容，此時配得的H2O2溶液濃度為1.96 mmol/L，4 ℃避光保存。H2O2溶液在使用之前配制。

過氧化氫酶溶液：準(zhǔn)確稱取0.531 4 mg過氧化氫酶溶于去離子水中配成10 mL溶液， 測得其活性約為170 U/mL[22]， 過氧化氫酶溶液在使用之前配制。

Britton-Robinson緩沖溶液配制方法參考文獻[23]。

1.2.2 ?反應(yīng)體系的建立 ?反應(yīng)在10 mL帶有刻度的棕色避光瓶中進行。首先通過計算確定好10 mL反應(yīng)混合液中各組成部分所需要的量（體積），然后用單道可調(diào)式移液器依次移取一定量的DES標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和HRP溶液至避光瓶中，再加入Britton-Robinson緩沖溶液，置于恒溫振蕩器中孵育15 min，最后加入H2O2溶液，使反應(yīng)混合液總體積為10 mL。蓋好避光瓶，并置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩（150 r/min）。定時取樣，并加入一定量過氧化氫酶使H2O2分解而終止反應(yīng)（可直接在離心管中進行）[24]。將樣品離心10 min，移取上清液，分析DES殘留濃度，計算DES去除率。

1.2.2 ?分析方法 ?DES濃度測定：用HPLC法，色譜條件是：色譜柱為Beckman UltraspHere ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇和水（70∶30，V/V），流速和進樣體積分別為1.0 mL/min和5 μL，檢測波長為240 nm，停留時間6.0 min，DES檢測的標(biāo)準(zhǔn)方程：峰面積=9 891.6CDES-6.106 2，R2=0.998 6。每次檢測做3個平行樣品，誤差小于5%。每次樣品測量前都采用外標(biāo)法確定DES校準(zhǔn)曲線方程，再確定未知樣DES濃度。

HRP活性測定采用ABTS法[25]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?pH對DES去除效果的影響

試驗測量了不同pH條件下DES的去除率，考察反應(yīng)體系pH變化對HRP催化氧化DES過程的影響。反應(yīng)起始條件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性為0.037 3 U/mL，反應(yīng)溫度為25 ℃，反應(yīng)時間為60 min，反應(yīng)體系的pH分別為3.16、3.98、4.51、4.90、6.00、7.00、8.08和9.03。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，DES的去除率隨pH的增加呈鐘型變化，即在3.16～9.03范圍內(nèi)，DES去除率隨pH增加先升高后降低;pH為4.51時，DES的去除率達到最高值93.62%;pH小于3.16或大于9.03時，DES去除率比較低，HRP催化活性受到限制。試驗結(jié)果表明，HRP能在一個比較寬的pH范圍內(nèi)催化氧化DES，適宜pH為4.51。

HRP能在pH4.00～11.00范圍內(nèi)催化底物反應(yīng)，因底物不同存在差異，催化多數(shù)底物反應(yīng)的適宜pH在7.00左右，pH小于4.00或大于11.00時，HRP催化活性很低[26，27]。但也有研究報道HRP催化H2O2氧化五氯代酚的適宜pH范圍為4.00～5.00[28]，與本研究結(jié)果比較相近。因此，以下試驗均選擇pH為4.50的緩沖溶液作為酶促反應(yīng)介質(zhì)，以保持HRP催化活性的相對穩(wěn)定。

2.2 ?溫度對DES去除率的影響endprint

反應(yīng)起始條件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性為0.037 3 U/mL，pH為4.50，反應(yīng)時間為30 min，反應(yīng)體系的溫度分別為15、20、25、30、35和40 ℃。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，DES去除率隨著反應(yīng)體系溫度的升高而逐漸升高，當(dāng)溫度超過35 ℃時，去除率急劇下降;反應(yīng)溫度為25 ℃時，DES去除率達到最大值90.13%;溫度在15 ～35 ℃范圍內(nèi)時，DES去除率均在80%以上。因此，HRP能在較寬的溫度范圍內(nèi)催化氧化DES，適宜溫度為25 ℃。溫度對酶催化反應(yīng)的影響表現(xiàn)在兩個方面：一是隨著溫度升高，酶促反應(yīng)活化分子增加，反應(yīng)速率增大;二是反應(yīng)溫度升高到一定值后，酶蛋白會發(fā)生變性，失去催化活性，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降。這兩種相反效應(yīng)使得酶促反應(yīng)存在一個適宜的溫度范圍。試驗結(jié)果表明，溫度超過35 ℃時，HRP催化活性明顯減弱，DES去除率僅為47%。研究HRP適宜的催化反應(yīng)溫度，有助于保護HRP的催化活性，提高DES去除率。

2.3 ?HRP與DES用量之比對DES去除率的影晌

酶的用量直接影響其工程應(yīng)用成本，考察HRP用量對DES去除率的影響，選擇最適宜的HRP用量（[HRP]0表示酶起始用量，U/mL），對降低工程應(yīng)用成本具有重要作用。反應(yīng)起始條件是：[DES]0=0.037 3 mmol/L，[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，pH為4.50，反應(yīng)溫度為25 ℃，[HRP]0/[DES]0起始比分別為0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 U/μmol，反應(yīng)時間分別為30和180 min。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著[HRP]0 /[DES]0增大， 即隨著HRP起始用量增加，DES去除率升高。當(dāng)[HRP]0 /[DES]0分別為0.250、0.5.00、1.000和2.000 U/μmol，反應(yīng)180 min后，DES去除率分別為89.81%、90.67%、92.08%和90.51%， DES去除率相差比較小，表明[HRP]0 /[DES]0達到一定量后，能夠滿足底物去除要求，過多的酶對反應(yīng)沒有催化作用。[HRP]0/[DES]0小于0.25 U/μmol時，DES去除率比較小，表明酶量不足。綜合考慮反應(yīng)速度和HRP催化活性隨反應(yīng)過程進行而減弱等因素，宜選擇[HRP]0/[DES]0=1.000 U/μmol作為反應(yīng)體系中HRP與DES的最佳配比。

2.4 ?H2O2濃度對DES去除率的影晌

如果僅考慮H2O2與DES發(fā)生的氧化還原反應(yīng)， 那么提高H2O2濃度，會加快反應(yīng)速度，增大DES去除率。但過量的H2O2容易使HRP失去催化活性[20]。因此，必須綜合考慮HRP催化活性和DES的去除率，選擇適宜的H2O2用量。本試驗在其他條件一定的情況下，通過改變H2O2濃度考察H2O2用量對DES去除率的影晌。反應(yīng)起始條件是：[DES]0=0.037 30 mmol/L，HRP起始活性為0.037 30 U/mL，pH為4.50，溫度為25 ℃，H2O2的濃度分別為0.004 66、0.009 32、0.018 65、0.037 30、0.074 60、0.149 20和0.298 40 mmol/L。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，當(dāng)H2O2濃度比較低時，如0.004 66和0.009 32 mmol/L，反應(yīng)2 h，DES去除率小于70%，且反應(yīng)速率（曲線的斜率）小，表明H2O2 濃度低，反應(yīng)速率小，不能將DES全部氧化;當(dāng)H2O2濃度處于0.018 65～0.074 60 mmol/L范圍內(nèi)時，反應(yīng)2 h，DES去除率達到90%以上，反應(yīng)速率大;H2O2濃度為0.074 60 mmol/L時，DES去除率達到最大值92.57%;當(dāng)H2O2濃度達到0.149 20 mmol/L時，反應(yīng)2 h后，DES去除率小于80%，表明H2O2濃度過高，對HRP催化氧化DES過程有明顯的抑制作用，原因是過量H2O2與反應(yīng)中間產(chǎn)物HRP-II進一步作用生成一種沒有催化能力的副產(chǎn)物HRP-Ⅲ[29]，從而降低DES的去除率。進一步用H2O2與DES的反應(yīng)摩爾比進行分析，數(shù)據(jù)處理結(jié)果參見圖5。圖5是反應(yīng)2 h后，DES去除率隨MH■O■∶MDES的變化曲線。

由圖5可以看出，MH■O■：MDES為1/8～2時，反應(yīng)2 h后，DES去除率從60.13%上升到92.57%，DES去除率隨MH■O■∶MDES增大而增大;當(dāng)MH■O■∶MDES為4時，DES去除率下降明顯，過量H2O2抑制了HRP催化反應(yīng)過程。理論上講，HRP催化氧化1 mol DES，只需要0.5 mol H2O2，即MH■O■∶MDES為0.5時，DES去除率應(yīng)達到最大[21]，但反應(yīng)2 h，MH■O■∶MDES為0.5～2.0時，DES去除率分別為90.01%、91.05%和92.75%。顯然，其他條件一定時，要完全氧化1 mol DES，MH■O■∶MDES需大于0.5。有關(guān)HRP催化H2O2氧化酚類底物的研究報道顯示，MH■O■：M底物因底物不同比值可以為0.5[30]、1.0[31]和1.6[32]。反應(yīng)消耗較多的H2O2，可能是由于底物氧化產(chǎn)物如二聚體小分子進一步被HRP催化氧化而增大了H2O2用量，使得H2O2用量高于理論用量[33]。

2.5 ?DES起始濃度對去除速率的影晌

本試驗通過測量反應(yīng)初始30 min內(nèi)DES去除速率（用30 min內(nèi)DES濃度變化除以30 min得到的平均反應(yīng)速率， 即去除速率）， 考察DES起始濃度對去除速率的影響，即對單位時間內(nèi)DES濃度變化率的影響。反應(yīng)初始條件是[H2O2]0=0.018 65 mmol/L，HRP起始活性為0.037 30 U/mL， pH為4.5，溫度為25 ℃。DES初始濃度分別為0.018 70、0.027 80、0.037 30 、0.046 60和0.056 00 mmol/L，反應(yīng)時間為30 min。結(jié)果如圖6所示。endprint

由圖6可以看出，在反應(yīng)的最初30 min內(nèi)，DES去除速率隨其起始濃度的增大而增大。原因是HRP催化H2O2氧化底物的4個反應(yīng)步驟中， DES參與了其中的兩個反應(yīng)， DES濃度高，反應(yīng)速率快，DES去除速率增大[34]。當(dāng)DES起始濃度大于0.037 30 mmol/L時，DES去除速率增加幅度開始減小，表明酶催化初始反應(yīng)速率受HRP量的限制，過多的DES對反應(yīng)速率影響很小。進一步用雙倒數(shù)法（濃度倒數(shù)和速率倒數(shù)）處理實驗數(shù)據(jù)，可得到以底物DES表示的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km，■=■■+■（圖7），V是DES去除速率（30 min內(nèi)的DES平均去除速率），單位為mmol/（L·h）?？梢郧蟪鯲max=74.63 mmol/（L·h），Km=46.75 mmol/L。本試驗結(jié)果得到Km值比HRP催化17β-雌二醇等雌激素反應(yīng)的米氏常數(shù)大[35]，原因可能是本數(shù)據(jù)處理使用30 min內(nèi)的平均速率代替初始反應(yīng)速率，存在一定的誤差。當(dāng)然，底物不同，同一種酶催化底物反應(yīng)的Vmax和Km也不同。

3 ?結(jié)論

試驗得出以下結(jié)論：

1）HRP 催化H2O2氧化DES的適宜pH為4.51。

2）HRP催化H2O2氧化DES的適宜溫度為25 ℃。

3）DES去除率隨[HRP]0/[DES]0增大而升高。當(dāng)[HRP]0/[DES]0大于0.5 U/μmol時， DES去除率超過90%。[HRP]0/[DES]0的適宜比值為1.000 U/μmol。

4）HRP催化H2O2氧化DES的MH■O■∶MDES宜大于0.5，以確保DES的去除率達到100%。H2O2用量過高，會抑制HRP催化活性，不利于DES的去除。

5）DES起始濃度越高，其去除速率越大。以底物DES表示的最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)Km分別為74.63 mmol/（L·h）和46.75 mmol/L。

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