劉雅芳 侯冠彧 于萍 趙春萍 曹婷 張立嶺

摘要：為了更有效地保護(hù)、管理和繁育緬甸蟒（Python bivittatus）瀕危物種，有必要利用分子技術(shù)對(duì)地方物種多樣性和遺傳分化進(jìn)行研究。試驗(yàn)采用TA克隆雙向測(cè)序方法對(duì)來(lái)自海南的37條緬甸蟒和來(lái)自越南的28條緬甸蟒部分控制區(qū)II序列進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，兩個(gè)地理群體共分為25個(gè)單倍型，單倍型多樣度（Hd）為0.877±0.025，核苷酸多樣性（π）為0.004 76±0.000 41，平均核苷酸差異數(shù)（k）為2.676，顯示緬甸蟒整體遺傳多樣性不高;通過(guò)比較兩群體遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)海南緬甸蟒的單倍型多樣度要高于越南緬甸蟒，但核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)低于越南緬甸蟒;基于控制區(qū)構(gòu)建ML樹(shù)和Network網(wǎng)絡(luò)分析顯示，兩群體均各自形成了明顯的兩大分支;通過(guò)計(jì)算得到兩群體的固定指數(shù)（Fst）為0.201（P<0.001），顯示海南緬甸蟒與越南緬甸蟒存在極顯著差異。

關(guān)鍵詞：緬甸蟒（Python bivittatus）;控制區(qū);遺傳多樣性;差異性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q959.6;Q78 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）02-0398-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.035

Genetic Diversity and Differentiation of Control Region Sequences in Mitochondrial Genome of Python bivittatus from Hainan and Vietnam

LIU Ya-fang1，HOU Guan-yu2，YU Ping1，ZHAO Chun-ping1，CAO Ting2，ZHANG Li-ling1，3

（1.Department of Animal Sciences， College of Agriculture， Hainan University， Haikou 570228，China;

2.Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737，Hainan，China;

3.Hainan Python Institute， Wenchang 571346， Hainan，China）

Abstract： It was necessary to study genetic diversity and differentiation of local species with molecular techniques for effectively protecting， managing and breeding Burmese python（Python bivittatus）. TA bidirectional sequencing was used to obtain part of mtDNA control region II of P.bivittatus from 37 Hainan individuals and 28 Vietnam individuals. A total of 25 haplotypes were obtained. Haplotype diversity（Hd）， nucleotide diversity π and the average number of nucleotide difference k were 0.877±0.025， 0.004 76±0.000 41 and 2.676， respectively， indicating that the genetic diversity of P.bivittatus was not very high. By comparing the genetic diversity of the two populations， the diversity of haplotype in P.bivittatus from Hainan was higher than that from Vietnam. The nucleotide diversity π and the average number of nucleotide difference k of the former population was lower. ML trees and network analysis based on mtDNA control region showed that the two populations were divided into 2 clades. The fixation index （Fst） reached 0.201（P<0.001）， indicating that there were significant differences between the two populations.

Key words：Python bivittatus; control region; genetic diversity; genetic differentiation

緬甸蟒（Python bivittatus）主要分布于東南亞國(guó)家和中國(guó)海南、云南、廣東、廣西、福建、四川等地[1]，是國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被列于《瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄II。緬甸蟒用途廣泛，蟒皮可用來(lái)制作民族樂(lè)器、高檔皮具，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000-2010年緬甸蟒皮的出口量?jī)H在越南就已達(dá)到年平均10萬(wàn)張[2];蟒油具有疏通經(jīng)脈、消腫抑菌等作用[3];蟒蛇膽具有止咳、祛痰、平喘等作用[4]。此外，緬甸蟒因性情溫順可愛(ài)，也是世界流行的寵物。如此大的市場(chǎng)需求，導(dǎo)致野生蟒蛇急劇減少，加上蟒蛇傳統(tǒng)棲息地面積的萎縮和數(shù)量的減少，使蟒蛇成為瀕危物種。有數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)大陸的野生蟒蛇僅約62 000條，且數(shù)量仍在減少[5]。

海南島位于中國(guó)南部，與越南隔海相望。島嶼具有與陸地界限明確、受陸地物種影響小等獨(dú)有特點(diǎn)，因此是研究物種進(jìn)化、演替和新物種形成的絕好地理環(huán)境。海南島蟒蛇具有這些特征。目前，關(guān)于越南緬甸蟒線粒體基因組全序列和來(lái)自海南緬甸蟒線粒體基因組全序列已經(jīng)公布[6]，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其在控制區(qū)II位置變異最大。此外，人們?cè)陲曫B(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)同齡海南緬甸蟒與越南緬甸蟒在個(gè)體大小和生長(zhǎng)速度上有顯著性差異，因此有必要利用分子技術(shù)探討這兩種緬甸蟒遺傳差異。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用線粒體上控制區(qū)、CYTB以及微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)緬甸蟒遺傳多樣性進(jìn)行了研究[7-9]，取得了一定的研究成果，對(duì)于地方種群的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、種群多樣性以及對(duì)入侵種群的管理有一定的參考價(jià)值，但目前關(guān)于海南緬甸蟒種群遺傳多樣性的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更有效地保護(hù)、管理和繁育緬甸蟒瀕危物種，特別是海南緬甸蟒，有必要采用現(xiàn)代分子遺傳技術(shù)對(duì)種群進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化分析。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定中國(guó)海南島和越南的緬甸蟒控制區(qū)II 3′端序列，研究?jī)傻胤椒N群緬甸蟒遺傳多樣性，探討海南與越南緬甸蟒遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳差異，以期能為海南和越南緬甸蟒的正確區(qū)分提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?樣本采集

本試驗(yàn)從海南蟒蛇研究所的10 000條蟒蛇中隨機(jī)抽取海南緬甸蟒37條、越南緬甸蟒28條，采用心臟采血法每條抽取1.5 mL血液，檸檬酸鈉抗凝，立即提取總 DNA（參照天根 DP304離心柱型基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作），檢測(cè)樣品濃度和純度，并稀釋至100 ng/μL，-20 ℃分裝保存。

1.2 ?PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物，上游引物序列為：5′-CTCCGAATAAATCCCAATC-3;下游引物序列為：5′–TTGTTGCCGCTTCTGTGG-3′。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：Taq Master Mix混合液25 μL，總DNA模板100 ng，最后補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶。將目的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序。具體步驟：T4 DNA連接酶作用下16 ℃過(guò)夜→連接至PMD20-T載體→轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α→LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h→挑取陽(yáng)性克隆菌落→菌落PCR驗(yàn)證→提取質(zhì)粒→生工生物工程（上海）股份有限公司ABI3730型全自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序。

1.3 ?序列分析

所得序列用DNASTAR 7.10中的SeqManII進(jìn)行序列校對(duì)及拼接。用BioEdit7.0軟件進(jìn)行多重比對(duì)，DnaSP3.0統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)、簡(jiǎn)約性位點(diǎn)、單倍型、核苷酸多樣性（π）、單元型多樣性（h）、平均核苷酸差異數(shù)（k）及中性檢驗(yàn)。用MEGA 3.1基于Kumar 2-parameter模型進(jìn)行種群內(nèi)遺傳距離及分子系統(tǒng)分析，進(jìn)化樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信度水平由自引導(dǎo)值（Bootstrap value）估計(jì)，重復(fù)次數(shù)為1 000。利用Arlequin 3.01軟件中分子方差分析（AMOVA）估算兩群體間的固定指數(shù)（Fst）。用Network進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?緬甸蟒控制區(qū)遺傳多樣性

在65條序列中，堿基組成如下：T為23.9%， ?C為 27.2%，A為37.8%，G為11.0%。A+T明顯高于C+G。共發(fā)現(xiàn)38個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，包括36個(gè)單變異位點(diǎn)和2個(gè)簡(jiǎn)約性位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換與顛換比為5.35。所有序列均已提交至GenBank（登錄號(hào)：KF991017-KF991081）。

除去控制區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)序列，得到長(zhǎng)度570 bp左右的65條序列。共定義25個(gè)單倍型（表1），其中單倍型Hap3頻率最高，為24.6%。其次是單倍型Hap16和Hap17，均為18.5%。65條緬甸蟒單倍型多樣度（Hd）、核苷酸多樣性（π）和平均核苷酸差異數(shù)（k）見(jiàn)表2?；贙imura 2 parameter模型計(jì)算65條緬甸蟒種群內(nèi)遺傳距離在0.002～0.016之間。

2.2 ?海南與越南緬甸蟒控制區(qū)差異

從表2可知，37條海南緬甸蟒控制區(qū)序列分為12個(gè)單倍型，單倍型比例為32.4%;28條越南緬甸蟒控制區(qū)序列分為15個(gè)單倍型，單倍型比例為53.6%。海南緬甸蟒的單倍型多樣度要高于越南緬甸蟒，但核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)低于越南緬甸蟒。群體固定指數(shù)Fst值在0.00～0.05之間，表明其各亞群間不存在分化;Fst值在0.05～0.15之間，為中度分化;Fst值在0.15～0.25之間，則為高度分化[10]。計(jì)算得出海南與越南緬甸蟒兩群體間的Fst值為0.201（P<0.001），遺傳距離為0.007，核酸歧義度（Dxy）為0.006 56±0.000 90，顯示兩群體間存在極顯著差異。

2.3 ?緬甸蟒分子進(jìn)化與單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析

利用65條緬甸蟒控制區(qū)序列構(gòu)建ML分子系統(tǒng)樹(shù)（圖1）。由圖1可知，海南緬甸蟒與越南緬甸蟒分為明顯的兩大分支（除Y9個(gè)體在海南緬甸蟒分支中和H24、H34個(gè)體在越南緬甸蟒分支中）。

對(duì)65條序列進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析（圖2），網(wǎng)絡(luò)以Hap3、Hap16、Hap17為中心。經(jīng)中性檢驗(yàn)，Tajimas D為-2.180 50（P<0.01）、Fu's Fs statistic為-16.963及Mismatch分析圖為單峰，表明緬甸蟒曾經(jīng)歷過(guò)群體擴(kuò)張事件。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?緬甸蟒的遺傳多樣性及保護(hù)

從表2中可以看出，緬甸蟒總體上群體遺傳具有較高的單倍型多樣度，但是表現(xiàn)出較低的核苷酸多樣性，顯示群體遺傳多樣性并不高。遺傳多樣性是一個(gè)種群進(jìn)化和生存的重要基礎(chǔ)，遺傳多樣性的缺失會(huì)威脅到種群的生存。加上棲息地的缺失和人類(lèi)的大量捕殺，緬甸蟒瀕危物種數(shù)量急劇下降。緬甸蟒的基因多樣性匱乏也給緬甸蟒的人工馴養(yǎng)及繁殖帶來(lái)一定的困難。在人工養(yǎng)殖中，應(yīng)加強(qiáng)遺傳管理，建立清晰詳細(xì)的譜系關(guān)系，防止近親衰退。同時(shí)可以引入遺傳多樣性高的種群，或?qū)⒏鬓r(nóng)戶的蟒蛋、幼蟒、種蟒進(jìn)行交換來(lái)提高本地蟒蛇種群基因交流程度，提高本地種群的遺傳多樣性。

3.2 ?海南與越南緬甸蟒遺傳分化

對(duì)比海南與越南緬甸蟒控制區(qū)II序列分析可知，相對(duì)于越南緬甸蟒來(lái)說(shuō)，海南緬甸蟒的單倍型多樣度高，核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)低，根據(jù)Wright的遺傳平衡理論，推測(cè)海南緬甸蟒可能是由一個(gè)小種群迅速增長(zhǎng)，長(zhǎng)期的地理和時(shí)間隔離，導(dǎo)致隨機(jī)的遺傳漂移，引起單倍型多樣度增大，但是沒(méi)有累積核苷酸方面的多態(tài)性[11]。構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)對(duì)于鑒別物種來(lái)源具有重要的參考價(jià)值。圖1中分子系統(tǒng)樹(shù)將65條緬甸蟒分為兩大支，其中一支海南緬甸蟒個(gè)體占97.2%，另一支越南緬甸蟒占93.1%，地理位置幾乎與ML分子系統(tǒng)樹(shù)完全對(duì)應(yīng)，表明海南與越南緬甸蟒起源于兩個(gè)不同的母系。進(jìn)一步利用Median Joining法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)分析圖，發(fā)現(xiàn)緬甸蟒分為3個(gè)主要的單倍型，Hap3、Hap16和Hap17。其中Hap3由87.5%越南緬甸蟒組成，Hap16、Hap17 100%由海南緬甸蟒組成。在單倍型網(wǎng)絡(luò)分析圖中也可看出海南與越南兩個(gè)明顯的區(qū)域，說(shuō)明海南與越南緬甸蟒在線粒體基因組的遺傳分化方面確實(shí)有明顯的差異，反映出這兩個(gè)群體在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的不同遺傳特征。

計(jì)算得出海南與越南緬甸蟒Fst為0.201，結(jié)果也表明兩個(gè)地理種群已出現(xiàn)較明顯的種群分化。海南與越南同屬熱帶季風(fēng)氣候，地理位置僅有一北部灣之隔，構(gòu)成了地理上的隔離。日積月累，使緬甸蟒在這兩個(gè)地方種群產(chǎn)生了極顯著的分化。Collins等[7]利用CYTB和控制區(qū)基因分析156條美國(guó)大沼澤地國(guó)家公園緬甸蟒，發(fā)現(xiàn)其群體內(nèi)遺傳分化很小，并與越南緬甸蟒群體Fst為0.088，呈現(xiàn)中度分化。You等[9]利用來(lái)自臺(tái)灣金門(mén)的26條緬甸蟒、來(lái)自福州的2條緬甸蟒和來(lái)自越南的5條緬甸蟒的CYTB和COI基因探討了臺(tái)灣金門(mén)島緬甸蟒起源，發(fā)現(xiàn)金門(mén)島與福州緬甸蟒最為接近，兩者都與越南緬甸蟒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，否認(rèn)了金門(mén)島上緬甸蟒來(lái)自東南亞地區(qū)。

對(duì)于不同物種，其表觀形態(tài)差距大，較易區(qū)分開(kāi)。但是對(duì)于同一物種不同地域種群來(lái)說(shuō)，很難通過(guò)形態(tài)特征來(lái)加以區(qū)分和研究。利用控制區(qū)序列來(lái)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，可以大致區(qū)分本地種和外來(lái)種，消除外來(lái)物種的基因可能混雜當(dāng)?shù)胤N群的潛在風(fēng)險(xiǎn)，也為野生動(dòng)物保護(hù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)及海關(guān)檢驗(yàn)蟒蛇的來(lái)源提供了一個(gè)生物學(xué)檢測(cè)方法。這種方法類(lèi)似于現(xiàn)在DNA條形碼概念，不同的是DNA條形碼大多數(shù)用于種及種以上的分類(lèi)和鑒定，對(duì)于種內(nèi)來(lái)源鑒別很少[12，13]。而控制區(qū)是線粒體上進(jìn)化最快的區(qū)域，常用來(lái)研究種內(nèi)遺傳分化和多樣性[14-16]?？傊?，通過(guò)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)、單倍型網(wǎng)絡(luò)分析圖和計(jì)算兩群體間的固定指數(shù)Fst，均已表明海南與越南緬甸蟒在分子水平上已出現(xiàn)明顯的分化。

本試驗(yàn)對(duì)海南和越南兩個(gè)地理種群緬甸蟒進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳差異研究，得出整體緬甸蟒群體遺傳多樣性并不高，但海南與越南緬甸蟒在分子水平上已出現(xiàn)明顯的分化。本研究成果對(duì)保護(hù)蟒蛇資源、鑒別蟒蛇活體及其產(chǎn)品的來(lái)源、人工養(yǎng)殖、種群管理等將具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙爾宓，黃美華，宗 ?愉.中國(guó)動(dòng)物志爬行綱[M].北京：科學(xué)出版社，1998.34-35.

[2] KASTERINE A， ARBEID R， CAILLABET O， et al. The Trade in South-East Asian Python Skins [M].Geneva：International Trade Centre （ITC）， 2012.

[3] 趙 ?靜，陳 ?琦，張立嶺，等.緬甸蟒脂肪酸分析[J].四川動(dòng)物， 2009（6）：899-900.

[4] 管淑玉，曾常青，劉廣鋒.中藥蛇膽的鑒別及質(zhì)量控制現(xiàn)狀[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（5）：537-539.

[5] 國(guó)家林業(yè)局.中國(guó)重點(diǎn)陸生野生動(dòng)物資源調(diào)查[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2009.

[6] 劉雅芳，曹 ?婷，劉建才，等.緬甸蟒線粒體基因組全序列測(cè)定與分析[J].四川動(dòng)物，2014，32（1）：24-31.

[7] COLLINS T M， FREEMAN B， SNOW S. Final report： genetic characterization of populations of the nonindigenous Burmese python in Everglades National Park[R]. Miami： Final Report for the South Florida Water Management District，2008.

[8] HUNTER M E， HART K M. Rapid microsatellite marker development using next generation pyrosequencing to inform invasive Burmese Python-Python molurus bivittatus-management [J]. Int J Mol Sci， 2013， 14（3）： 4793-4804.

[9] YOU C W， LIN Y P， LAI Y H， et al. Return of the pythons： first formal records， with a special note on recovery of the Burmese python in the demilitarized Kinmen islands [J]. Zoological Studies， 2013， doi：10.1186/1810-522X-52-8.

[10] WRIGHT S. Evolution and the Genetics of Populations. Volume 4. Variability Within and Among Natural Populations [M]. Chicago： University of Chicago Press，1978.

[11] AVISE J C. Phylogeography the History and Formation of Species [M]. Cambridge： Harvard University Press， 2000.

[12] VENCES M， THOMAS M， BONETT R M，et al. Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding： chances and challenges[J]. Phil Trans R Soc B， 2005， 360（1462）：1859-1868.

[13] WHITTAKER D J， MORALES J C， MELNICK D J. Resolution of the Hylobates phylogeny： Congruence of mitochondrial D-loop sequences with molecular， behavioral， and morphological data sets[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2007， 45（2）：620-628.

[14] NORMAN J A，MORITZ C， LIMPUS C J.Mitochondrial DNA control region polytmorphisms：genetic ? markers for ecological studies of marine turtles[J]. Molecular Ecology， 1994， 3（4）：363-373.

[15] BARBER P H. Phylogeography of the canyon treefrog， Hyla arenicolor（Cope） based on mitochondrial DNA sequence data [J]. Molecular Ecology， 1999， 8（4）：547-562.

[16] 李慧芳，徐文娟，朱文奇，等.福建省家鴨的遺傳多樣性及其與野鴨的親緣關(guān)系[J].生物多樣性，2008，16（6）：607-612.