林瀟 唐明燈

靶向表皮生長因子受體分子探針研究進展

林瀟 唐明燈

許多惡性腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及不良的預(yù)后已被證實與表皮生長因子受體（EGFR）的過度表達相關(guān)。目前，針對這個靶點，美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了多個靶向EGFR藥物，如吉非替尼、厄洛替尼，但治療效率總體偏低。核醫(yī)學(xué)顯像能夠在分子水平上評價EGFR的表達水平及其突變程度，從而為臨床個性化治療提供有力依據(jù)。筆者簡述靶向EGFR分子探針及其存在的缺點，以期為進一步研究提供幫助。

表皮生長因子受體；體層攝影術(shù)，發(fā)射型計算機，單光子；正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)；分子探針

癌癥嚴(yán)重危害人類健康，根據(jù)美國癌癥協(xié)會2013年統(tǒng)計報告公布，目前全世界范圍內(nèi)每死亡8人，其中就有1人死于癌癥。在2008年，全世界約有1270萬人被診斷出患有癌癥，約760萬人死亡。預(yù)計到2030年，新發(fā)癌癥患者將達到2130萬人，將有1310萬人死亡。

癌癥的傳統(tǒng)治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療，這些方法雖然已大幅度改善腫瘤的治療效果，但仍存在不良反應(yīng)、缺乏特異性、容易對正常組織產(chǎn)生損傷等缺點。因此，仍需要尋找更有效的治療方法來改善治療效果。

隨著腫瘤生物學(xué)的發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的過度表達或突變會對腫瘤的生物學(xué)性質(zhì)以及治療效果有顯著影響，提出通過阻斷這些基因來控制和治療腫瘤，這就是分子靶向治療[1]。即針對不同的靶點，選擇不同的靶向藥物進行特異性地治療。其中，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在實體瘤中的過度表達與腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2－3]。然而，采用EGFR進行分子靶向治療能夠取得良好療效的患者比例并不高。臨床實驗顯示，Erlotinib和Gefitinib治療非小細胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）僅對10%～15%的患者有效[4]。卵巢癌、頭頸癌、食道癌、宮頸癌、膀胱癌、乳癌、結(jié)直腸癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后均與EGFR的過度表達以及突變狀態(tài)相關(guān)[5]?？梢娫诎邢蛑委熐埃瑢颊哌M行EGFR表達水平的評估十分必要。目前，臨床上用于檢測EGFR表達水平的方法主要有活檢和血清學(xué)檢測[6]，但都存在一定的缺陷。相比之下，核醫(yī)學(xué)顯像能夠無創(chuàng)地對腫瘤進行分子水平上的評價，其靈敏度高，可重復(fù)性強，能為臨床治療提供十分有利的依據(jù)。目前，檢測EGFR的藥物主要分為2類：單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑[7]。

1 單克隆抗體類

1.1 單光子核素標(biāo)記類

EGF是由53個氨基酸組成的蛋白，Reilly等[8]采用111In直接對EGF進行標(biāo)記，在hEGF上引入DTPA，制得111In-DTPA-hEGF，標(biāo)記時間約為15 min，約70%的111In-DTPA-hEGF與人乳腺癌MDA-MB-468細胞特異性結(jié)合。

Reilly等[9]同樣采用111In標(biāo)記DTPA連接的抗EGFR的單克隆抗體Mab 528，與111In-DTPA-hEGF在荷人乳腺癌MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞、MDA-MB-468細胞、JW-97細胞的無胸腺小鼠體內(nèi)進行對比發(fā)現(xiàn)，111In-DTPA-Mab528（21.6%ID/g）的腫瘤攝取值是111In-DTPA-hEGF（2.2%ID/g）的10倍。并且對荷MDA-MB-468以及JW-97腫瘤的小鼠顯像發(fā)現(xiàn)，111In-DTPA-Mab528對腫瘤的探測效果更好。

Jung等[10]將EGF和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）生物素分子相連，再分別連接99Tcm-肼基尼古酰胺（hydrazino nicotinamide，HYNIC）標(biāo)記的avidin-FITC（Av）和streptavidin-Cy5.5（Sav）。99Tcm-Av-EGF和99Tcm-Sav-EGF兩個探針在體外與靶細胞特異性結(jié)合，但在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和生物學(xué)分布則各不相同。99Tcm-Av-EGF在體內(nèi)快速代謝（T1/2= 4.3 min），在肝中攝取高而腫瘤攝取低（4 h：0.6% ID/gm）。99Tcm-Sav-EGF在體內(nèi)代謝時間較長（T1/2= 51.5 min），非特異性攝取低，腫瘤攝取相對較高（3.8%ID/gm）。Jung等[11]將EGF和99Tcm-HYNIC用PEG鏈相連，再連接在鏈霉親和素包裹的量子點上。探針99Tcm-HYNIC-EGF-PEG-Qdot表現(xiàn)出對EGFR的高親和力。靜脈注射后，無論是光學(xué)成像還是放射性掃描成像，都能清晰地探測到MDAMB-468腫瘤。另外，對MDA-MB-468腫瘤的系列成像發(fā)現(xiàn)，隨著西妥昔單抗（Cetuximab，C225）治療的進行，EGFR表達降低，而腫瘤攝取也成比例地顯著降低。量子點的最大缺點是納米顆粒的不良作用還不甚明確。

西妥昔單抗是人/鼠嵌合型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）單克隆抗體，它可以高親和力地與EGFR結(jié)合，從而阻礙內(nèi)源性配體與EGFR的結(jié)合，阻斷EGFR激活，從而阻斷EGFR依賴的腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及血管生成等生物學(xué)效應(yīng)，還可引起受體的二聚化、內(nèi)化和下調(diào)[12]。Schechter等[13]使用乙二半胱氨酸（ethylenedicysteine，EC）作為雙功能連接劑，制備得到99Tcm-ECC225。體內(nèi)分布實驗顯示，腫瘤靶與非靶比值隨時間增加。

基于EGFR的免疫治療特異性抗體，如帕尼單抗（panitumumab）和西妥昔單抗，均表現(xiàn)出優(yōu)良的臨床前景。但是越來越多的研究表明，僅有部分患者能夠從中得益，并且在有治療效果的患者中也會產(chǎn)生抗藥性。因此，Liu等[14]將panitumumab和cetuximab單抗與1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四羧酸（1，4，7，10-tetraazcy clododecane-N, N′，N，N′-tetraacetic acid，DOTA）相連，再用177Lu進行標(biāo)記，得到177Lu-DOTA-panitumumab（177Lu-Pan）和177Lu-DOTA-cetuximab（177Lu-Cet）。在UMSCC-22B腫瘤模型小鼠中進行的SPECT/CT顯像和生物分布實驗顯示，二種顯像劑都有不錯的腫瘤靶向性。177Lu-Pan的腫瘤攝取值更高[（24 h：20.92± 4.45）%ID/g]，生物免疫實驗也顯示其抑制腫瘤生長的效果更加明顯。

單抗應(yīng)用于顯像診斷普遍存在一些缺點，如半衰期較長、滲透性差和鼠源免疫性等。與之相比，人或是人源化的抗體片段可能更適合進行成像診斷。Xu等[15]和Wang等[16]對已有的抗體片段Fab進行125I標(biāo)記，在EGFR表達水平遞減的3種腫瘤（人皮膚鱗癌A431細胞、人膠質(zhì)瘤U118細胞和人黑色素瘤M14細胞）模型小鼠中進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射后1 h，A431腫瘤攝取十分顯著，U118腫瘤也清楚可辨。而M14腫瘤中的攝取在4 h之內(nèi)迅速地降低；在注射后9 h，A431和U118腫瘤中的攝取愈發(fā)顯著，而M14腫瘤中的攝取值已趨于本底。比較T/N值，A431隨時間不斷增加，注射后48 h達到峰值（約為15）；U118也隨時間增加，注射后15 h達到峰值（約為7）；M14腫瘤則無明顯變化。因此，研究認為，125I-Fab有望區(qū)分EGFR的表達水平。

1.2 正電子核素標(biāo)記類

在NSCLC中，40.3%的EGFR基因突變是由外顯子21突變引起，并且94.4%的突變是第858位密碼子發(fā)生了堿基（T→G）突變，從而使該位點的氨基酸由亮氨酸變?yōu)榫彼帷＿@個過程稱為L858R[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，部分NSCLC患者在使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療10個月后出現(xiàn)耐藥性，此結(jié)果與EGFR基因20號外顯子T790M基因突變有關(guān)。

Pal等[18]合成制備了4-[（3-iodophenyl）amino]-7-{2-[2-{2-（2-[2-{2-（[18F]fluoroethoxy）-ethoxy}-ethoxy] -ethoxy）-ethoxy}-ethoxy]}-quinazoline-6-yl-acrylamide（[18F]F-PEG6-IPQA），體外實驗發(fā)現(xiàn)，該探針選擇性地濃聚于表達L858R型突變的EGFR的NSCLC細胞上，PET顯像能夠區(qū)分對EGFR TKI治療敏感的L858R型突變的NSCLC與表達野生型EGFR的NSCLC。Yeh等[19]則發(fā)現(xiàn)，與野生型以及T790M基因突變型EGFR相比，[18F]F-PEG6-IPQA能夠選擇性地與L858R基因突變的EGFR激酶相結(jié)合。

Pal等[20]體外實驗顯示，morpholino-[124I]-IPQA在A431細胞以及經(jīng)過基因改造而表達EGFRⅧ的U87細胞中快速聚集并滯留良好，而在野生型EGFR的U87MG細胞中的表達則恰恰相反。同時，morpholino-[124I]-IPQA通過PET顯像能夠得到A431皮下腫瘤的EGFR活性，而對于人慢性粒細胞白血病K562細胞發(fā)展而來的皮下腫瘤則結(jié)果相反。因此，該研究認為，morpholino-[124I]-IPQA能夠探測EGFR酶信號活性高的腫瘤，包括EGFRⅧ突變的腦腫瘤和表達功能獲得型EGFR酶突變的NSCLC。但不足的是，該顯像劑由肝膽腸道排泄，腸道顯影較高，影響該部位腫瘤的判斷。

Cetuximab是第一個被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療的EGFR特異性的單抗，目前也應(yīng)用于其他實體瘤的治療[21]。Cai等[22]將西妥昔單抗與DOTA相連，用64Cu進行標(biāo)記，制備得到64Cu-DOTA-Cetuximab，并在7種腫瘤模型中進行測定，通過MicroPET顯像發(fā)現(xiàn)，64Cu-DOTA-Cetuximab在EGFR高表達的腫瘤細胞中攝取高，而EGFR低表達的腫瘤中攝取相對較低。攝取值與EGFR表達水平（用western blotting測量）有良好相關(guān)性。Sadri等[23]在荷人乳腺癌MDA-MB-468腫瘤的裸鼠中對64Cu-DOTA-Cetuximab進行評價發(fā)現(xiàn)，腫瘤攝取值高，在注射后4 h腫瘤攝取值為（11.65±3.89）%ID/g；24 h可達到（20.91±2.49）%ID/g。另有研究發(fā)現(xiàn)，64Cu-DOTA-Cetuximab在荷人宮頸癌細胞（Caski）裸鼠中有相對較高的腫瘤攝取，但在血液和肝臟中的攝取值也比較高[24]。Niu等[25]在頭頸部鱗狀細胞癌中的研究結(jié)論卻不相同，UMSCC-22B細胞的EGFR表達水平低于鱗狀細胞癌（SCC1）細胞，然而，UM-SCC-22B細胞中的64Cu-DOTA-Cetuximab卻高于SCC1細胞。89Zr-Cetuximab是通過琥珀去鐵胺B（succinylated desferrioxamine B，N-sucDf）進行標(biāo)記得到的[26]。Aerts等[27]對其評價發(fā)現(xiàn)，測量得到的EGFR水平和PET檢測到的信號并不成比例。EGFR表達水平處于中位的細胞株的腫瘤/血液比值顯著高于EGFR表達水平最高的細胞株。正常組織中的攝取則沒有太大區(qū)別?？贵w的攝取和EGFR表達水平直接存在差異，提示藥代動力學(xué)和藥效對腫瘤治療存在的影響不容忽視。

Miao等[28]用N-[2-（4-18F-fluorobenzamido）ethyl] maleimide（18F-FBEM）和affibody類似物Ac-Cys-ZEGFR：1907耦合，制得探針18F-FBEM-Ac-Cys-ZEGFR：1907，結(jié)果顯示，該探針與A431細胞的親和力為37nmol/L，在腫瘤中快速攝取及聚集，注射后3 h除了肝和腎以外的其余臟器均已清除，因此有很好的腫瘤靶與非靶比值。在A431腫瘤模型中，18F-FBEM-Ac-Cys-ZEGFR：1907探針與45 μg Ac-Cys-ZEGFR：1907共同注射，能夠提高腫瘤的攝取值；而在顯像時與500 μg Ac-Cys-ZEGFR：1907共同注射，能夠顯著抑制腫瘤的攝取。

2 小分子TK1

在小分子EGFR-TK1方面，應(yīng)用最廣泛的是4-氨基喹唑啉類衍生物。

2.1 正電子核素標(biāo)記類

1999年，F(xiàn)redriksson等[29]報道合成了11CPD153035，并在荷神經(jīng)細胞瘤的小鼠體內(nèi)進行了生物評價。Meng等[30]對21例患者進行了11CPD153035的臨床研究，認為其可用于檢測NSCLC患者對EGFR-TK1的響應(yīng)情況，但不適合用于檢測靶向治療的效果。

吉非替尼（Gefitinib，ZD1839，Iressa）和厄洛替尼Erlotinib（OSI-774，Tarceva）是美國食品和藥物管理局已批準(zhǔn)的兩個選擇性EGFR-TK1，用于晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC的治療，目前這兩種藥物也處于其他類型腫瘤的臨床試驗中。2009年Memon等[31]報道合成了11C-Erlotinib，并在荷肺癌模型小鼠中進行了microPET顯像。Memon等[32]對13例將進行erlotinib治療的NSCLC患者預(yù)先進行了11C-Erlotinib顯像，并與18F-FDG進行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11C-Erlotinib在4例患者體內(nèi)的一處或多處肺癌或淋巴轉(zhuǎn)移部位濃聚，而18F-FDG PET/CT則不能發(fā)現(xiàn)病灶。其中，除1例患者死亡之外，其余3例患者在erlotinib治療后均有一定的病情改善。2006年，Holt等[33]用11C標(biāo)記Gefitinib，得到11CGefitinib。Zhang等[34]在荷NFSa腫瘤的小鼠體內(nèi)進行生物分布實驗顯示，11C-Gefitinib特異性地濃聚于腫瘤，腫瘤/血液以及腫瘤/肌肉的比值隨時間逐漸增高，0～60 min分別由0.4和0.6升高為6.0和5.0。Murali和Flores[35]和Seimbille等[36]都采用18F對4位上的F原子進行取代，成功制得18F-Gefitinib，與11C-Gefitinib標(biāo)記方法類似，并沒有改變Gefitinib的結(jié)構(gòu)。然而，18F-Gefitinib在體內(nèi)和體外均未表現(xiàn)出與EGFR表達水平或功能水平相關(guān)[37]。

在可逆抑制劑中，18F-ML01[38]由于細胞中的ATP濃度高，使得其在腫瘤細胞中被快速排出，從而不能作為合格的顯像劑。在不可逆抑制劑中，11C-ML03[39]由于喹唑啉環(huán)上的丙烯酰胺基團的不飽和性，從而在體內(nèi)代謝快，生物利用度低，在腫瘤中的攝取值不高。因此，研究人員選擇穩(wěn)定性好的水溶性化合物[40]進行11C標(biāo)記，得到11C-ML04[41]。鑒于11C的半衰期較短（T1/2=20.39 min），Dissoki等[42]用18F（T1/2=109.8 min）對其進行標(biāo)記，得到18F-ML04。18F-ML04需要六步放射合成，合成時間為4 h。在荷人膠質(zhì)瘤細胞的小鼠中進行的生物分布實驗顯示，靶與非靶比值在注射后3 h達到最高，腫瘤/血液和腫瘤/肌肉的值分別約為7和5。然而無論是使用EGFR低表達的U138MG腫瘤或是使用非放射性的ML04進行抑制，都只有小部分的特異性攝取[43]。Shaul等[44]用不同的支鏈取代ML03中的丙烯酰胺基團，在苯胺環(huán)上進行124I標(biāo)記，制得3種標(biāo)記物：124I-ML06、124I-ML07和124I-ML08，其中124I-ML06和124I-ML08都是不可逆的抑制劑，而124IML07是部分不可逆抑制劑。

阿法替尼（Afatinib，BIBW 2992）是一種不可逆的ErbB家族的阻斷劑，能夠抑制EGFR、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）以及ErbB4的酶活性[45]。2013年，阿法替尼經(jīng)美國食品與藥物管理局核準(zhǔn)上市，用于治療EGFR突變的NSCLC患者。Slobbe等[46]用18F對Afatinib進行標(biāo)記，得到標(biāo)記物18F-Afatinib，并在荷A549和人肝癌HCC827兩種腫瘤細胞小鼠中進行生物分布實驗，結(jié)果表明，這兩種腫瘤在5 min時攝取值達到最高并且滯留良好，攝取值保持在1%ID/g左右。非靶器官清除較快，腫瘤/血液值在注射后120 min分別為2.26（A549）和2.59（HCC827）；腫瘤/肌肉值在注射后120 min分別為6.37（A549）和3.83（HCC827）。

2.2 單光子核素標(biāo)記類

Fernandes等[47]在Gefitinib的結(jié)構(gòu)上進行修飾，在喹唑啉環(huán)的C6位置上連上溴代的丙酰胺，用125I標(biāo)記，得到標(biāo)記物125I-N-{4-[（3-chloro-4-fluorophenyl）amino]quinazoline-6-yl}-3-iodopropionamide。體外實驗表明，非放射性化合物能抑制A431細胞的生長和EGFR的磷酸化。然而，在體內(nèi)卻表現(xiàn)出快速地脫碘現(xiàn)象。研究認為，這是由于脂肪鏈上的C-I鍵穩(wěn)定性差所導(dǎo)致的，如果能夠?qū)⒌鈽?biāo)記在苯環(huán)上，就能夠提高其穩(wěn)定性。在C6上改用苯甲酰胺，將125I分別標(biāo)記在對位和間位上，得到的標(biāo)記物穩(wěn)定性好，在A431細胞中攝取值高，在正常小鼠體內(nèi)生物分布顯示，其血液清除快且主要通過肝膽進行代謝[48]。

Bourkoula等[49]將6-氨基-4-（3-溴苯）氨基喹唑啉與吡啶甲醛反應(yīng)生產(chǎn)亞胺，用“4+1”的策略與[M（CO）3]+（M=99Tcm和Re）連接，形成穩(wěn)定的配合物。在健康小鼠中，注射后1～15 min，配合物在血液和軟組織中快速清除，注射后15～180 min，清除速度減緩。

Hirata等[50]用125I標(biāo)記PD153035的類似物m-IPQ，得到125I-m-IPQ。該探針對EGFR-TK抑制能力強，其在非靶組織中清除快，但在胃中有攝取，表明其不夠穩(wěn)定，有脫碘現(xiàn)象。為了改善其穩(wěn)定性，該研究者設(shè)計合成了PHY和BAY兩個化合物，二者同樣也有高抑制力（IC50值分別為：12.7± 7.2 nmol/L和51.0±8.9 nmol/L），且在胃中的攝取低，表明相比125I-m-IPQ，穩(wěn)定性有所改善。其中125I-PHY的靶/非靶值相對較高，腫瘤/血液和腫瘤/肌肉的值分別為0.94～1.50和1.02～1.95[51]。為了進一步提高靶/非靶值，該研究者對PHY的結(jié)構(gòu)進行修飾，在喹唑啉環(huán)的6位上引入6種不同的支鏈。其中6-（3-Morpholinopropoxy）-7-ethoxy-4-（3’-iodophenoxy）quinazoline（125I-PYK）表現(xiàn)出高腫瘤攝?。? h：4.37±0.65）并且滯留性能良好（24 h：1.53± 0.15）。同時，在非靶組織中清除較快，因此腫瘤/血液和腫瘤/肌肉的值均隨時間不斷增加，到24 h時，能分別達到57.0和45.5[52]。

在小分子TKI方面，放射性核素標(biāo)記的不可逆型EGFR激酶抑制劑與可逆型相比，表現(xiàn)出更好的顯像能力。在進行結(jié)構(gòu)修飾時，需要考慮脂溶性對生物性能的影響：降低脂溶性會降低肝膽攝取，但同時可能會降低其細胞穿透力從而降低EGFR激酶結(jié)合力；而脂溶性配體如果親和力過高又會使得探針運輸取代受體結(jié)合成為決速步，因此，該探針更多反映的是局部血流的差異而不是受體結(jié)合位點的差異。另外，目前已有的探針在體外都表現(xiàn)出不錯的性能，但在體內(nèi)的顯像效果卻并不如預(yù)期，一種可能的解釋是靶向藥物是通過口服給藥，而靶向顯像藥物則是通過靜脈注射給藥[53]。

3 小結(jié)

分子靶向治療是腫瘤治療的熱點與方向，其中，EGFR靶向治療在諸多腫瘤治療中起到重要作用。然而，EGFR靶向治療成效與腫瘤EGFR的表達以及突變情況有很大關(guān)系。PET/SPECT能夠在分子水平上提供腫瘤內(nèi)EGFR的表達和突變水平，且具有無創(chuàng)特性和可重復(fù)性，因此能夠為臨床治療提供有力依據(jù)。目前已有諸多的PET/SPECT EGFR靶向探針，有的已經(jīng)在臨床試驗上取得不錯的效果，在未來，將有很多性能優(yōu)異的靶向探針不斷涌現(xiàn)出來，使EGFR分子成像轉(zhuǎn)化到臨床成為可能。

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Research progresses on molecular probes targeting epidermal growth factor receptor

Lin Xiao, Tang Mingdeng.Department of Nuclear Medicine,Fujian Provincial Cancer Hospital,Fuzhou 350014, China

Tang Mingdeng,Email：tmd0603@126.com

Overexpression of epidermal growth factor receptor（EGFR）has been confirmed to be associated with cell malignancy，metastasis and poor prognosis.Against this target,several drugs have been approvaled,such as gefitinib and erlotinib.However,the therapeutic effect was not satisfied.PET/ SPECT imaging can evaluate the expression and mutation of EGFR at molecular level to provide the basis for individual treat.This article is an overview of the progress of PET/SPECT molecular probes targeting EGFR and related problems in order to provide help for further research.

Epidermal growth factor receptor;Tomography,emission-computed,single-photon; Positron emission tomography;Molecular probes

2014-11-10）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.01.018

350014福州，福建省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

唐明燈（Email：tmd0603@126.com）