趙邯鄲　關(guān)淑艷　徐丹丹　劉雙　陳沼汀

摘要：以玉米（Zea mays L.）自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將帶有pCAMBIA1301-BADH抗鹽堿基因轉(zhuǎn)入供試品種的胚性愈傷中， 通過愈傷組織對鹽（NaCl）的敏感性試驗(yàn)，確定愈傷組織適宜選擇壓，同時研究了2，4-D濃度對篩選結(jié)果的影響。結(jié)果表明，玉米自交系H99在鹽篩培養(yǎng)基中NaCl濃度為200 mmol/L，2，4-D濃度為1.0 mg/L時篩選結(jié)果最佳。對移栽成活的48棵抗鹽轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-BADH基因植株，經(jīng)PCR檢測有3株呈陽性，陽性株率達(dá)到6.3%，初步證明目的基因已整合到玉米基因組中。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；愈傷組織；耐鹽性；篩選；NaCl

中圖分類號：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0206-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.054

鹽堿地在世界上分布廣泛，世界陸地總面積的7.6%為鹽堿地[1，2]。中國是世界鹽堿地大國之一，約有鹽堿地0.27億hm2[3]。土壤鹽堿化是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要環(huán)境因素。隨著灌溉面積的擴(kuò)大，因灌溉水質(zhì)下降及不合理的灌溉方式而引起的土壤次生鹽漬化現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重[4，5]。因此，對現(xiàn)有作物品種進(jìn)行改良，培育耐鹽作物新類型，已成為十分重要的研究對象。玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物之一，也是最佳的飼料加工原料，還是重要的工業(yè)原料，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著舉足輕重的地位。在中國人口增加及耕地面積逐漸減少的情況下，對玉米的需求也正在與日俱增。另外，中國是世界玉米生產(chǎn)大國，玉米對中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和市場穩(wěn)定具有非常重要的作用。

隨著轉(zhuǎn)基因作物商品化的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)深入生活，同時也創(chuàng)造出巨大的效益。因此，培育出具有高產(chǎn)、耐鹽、耐旱等優(yōu)良性狀的玉米一直是玉米育種工作者努力追求的奮斗目標(biāo)[6]。在20世紀(jì)90年代，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究工作得到了飛速發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)法、PEG法、子房注射法等不僅在玉米上成功使用，而且技術(shù)完善成熟[7-9]。農(nóng)桿菌是自然界中存在的天然基因工程載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其他轉(zhuǎn)化方法相比，具有轉(zhuǎn)化效率高、可轉(zhuǎn)移較大的DNA片段、轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)低、遺傳較穩(wěn)定及整合機(jī)理清楚等優(yōu)點(diǎn)，所以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法改良糧食作物的產(chǎn)量及性狀一直是研究的熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)以玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將帶有pCAMBIA1301-BADH的抗鹽堿基因轉(zhuǎn)入玉米胚性愈傷中，通過愈傷組織對NaCl的敏感性試驗(yàn)，確定了篩選抗鹽基因玉米愈傷組織的有效選擇壓，研究了2，4-D濃度對篩選結(jié)果的影響，以期為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)，為玉米基因育種研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 采用玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，3份材料由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株EHA105、質(zhì)粒pCAMBIA1301-BADH，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）基本培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基。

2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+700 mg/L L-脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D。

3）繼代培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+1.0 mg/L 2，4-D。

4）篩選培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+不同濃度2，4-D+不同濃度NaCl。

以上培養(yǎng)基中均含4%蔗糖和0.8%瓊脂，pH 5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)材料的處理 取經(jīng)人工套袋授粉10～15 d的飽滿且無病蟲害的玉米雌幼穗扒去最外層數(shù)片苞葉，留3～5個苞葉，切取雌果穗頭部無子粒部分，用75%乙醇浸泡10 min，扒去所有苞葉及花絲后再用50%的次氯酸鈉溶液浸泡15～20 min，然后將果穗置于超凈工作臺上，用無菌水沖洗3～4次，并削去中部子粒的上面1/3胚乳，用解剖針挑出大小約1.5～2.0 mm的幼胚。

1.2.2 玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代 取剝離玉米穗中部子粒的幼胚，將盾片向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。分別將H99、丹988、丹598玉米自交系的玉米幼胚接種到20個皿中，每個培養(yǎng)皿中接種30個盾片，從誘導(dǎo)出的愈傷組織中挑選不透明、淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織夾碎到2～3 mm大小，每皿接種30塊，視各基因型產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量的差異，擴(kuò)繁的數(shù)量也不同，以滿足后續(xù)試驗(yàn)需求為宜。每15 d繼代1次，共繼代4次。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并用含有質(zhì)粒pCAMBIA1301-BADH的農(nóng)桿菌菌株劃板于YEP固態(tài)培養(yǎng)基（含1 mg/L Kan）中培養(yǎng)，挑單菌落接種于5 mL YEP液態(tài)培養(yǎng)基（含1 mg/L Kan）中，28 ℃振蕩過夜培養(yǎng)，隔天放入50 mL YEP液態(tài)培養(yǎng)基中至其對數(shù)生長期OD值為0.5～0.6，離心收集菌體將其重懸于侵染液中備用，將預(yù)培養(yǎng)愈傷組織置于重懸后的菌液中，浸泡25 min，輕搖振蕩，倒掉菌液，將外植體放入鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液，然后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（含200 μg/L As），黑暗條件下培養(yǎng)3 d。

1.2.4 鹽脅迫培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上獲得的3個品種H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織接種到不同濃度的鹽脅迫篩選培養(yǎng)基上，NaCl濃度梯度依次為0、50、100、150、175、200、250、275、300 mmol/L， 2，4-D濃度梯度依次為0、1.0、2.0、3.0 mg/L，每個梯度設(shè)置3次重復(fù)。以不添加NaCl和2，4-D的培養(yǎng)基為對照，20 d后及時統(tǒng)計愈傷組織存活率。根據(jù)愈傷組織存活率，確定愈傷組織最適宜的選擇壓。將篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，分化出的苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基[11]。endprint

愈傷組織存活率=存活的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%。

1.3 PCR檢測

取抗性植株的葉片按照CTAB方法提取植物基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性55 s，退火50 ℃ 55 s，72 ℃延伸55 s，72 ℃后延伸10 min，35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度對玉米自交系篩選結(jié)果的影響

用玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈傷組織進(jìn)行耐鹽性研究，觀察統(tǒng)計各處理愈傷組織成活情況，用愈傷組織成活率分析玉米愈傷組織的耐鹽性敏感濃度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高，各基因型的愈傷組織存活率明顯下降，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到300 mmol/L時，愈傷組織全部死亡；NaCl的半致死濃度稍高于175 mmol/L，對篩選結(jié)果有較明顯影響；在NaCl濃度為200 mmol/L時鹽篩結(jié)果最佳，這3種不同基因型玉米自交系中，H99的鹽篩結(jié)果最佳。

2.2 不同2，4-D濃度對玉米自交系篩選結(jié)果的影響

如圖2所示，2，4-D濃度過高或過低都會影響不同基因型玉米自交系愈傷組織在篩選培養(yǎng)基中的存活率，其中2，4-D濃度為1.0 mg/L時鹽篩結(jié)果最佳。2，4-D濃度不同對不同基因型玉米自交系的篩選結(jié)果也不相同。由不同濃度的2，4-D對3種基因型玉米自交系愈傷組織篩選的影響可知，其對H99基因型的鹽篩結(jié)果的影響最明顯。

2.3 抗性植株的PCR檢測

用CTAB法提取的玉米再生植株葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化玉米獲得轉(zhuǎn)BADH基因再生植株，利用BADH引物按照PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果（圖3）表明，轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出1 500 bp左右的特異條帶，與陽性質(zhì)粒作模板的PCR擴(kuò)增條帶大小吻合，而非轉(zhuǎn)基因的對照植株則無此特異條帶，初步證明BADH基因已整合到再生玉米植株中。經(jīng)過篩選、分化、生根、移栽，有48株轉(zhuǎn)基因植株成活，通過在大棚種植，經(jīng)過PCR檢測，其中陽性植株為3株，PCR陽性植株率為6.3%。

3 小結(jié)與討論

植物組織和細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生多種變異，若在加有高濃度鹽分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織和細(xì)胞，有可能篩選出耐鹽細(xì)胞并再生出植株[12，13]。這種方法近10多年來受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，并取得了一定的進(jìn)展，現(xiàn)已篩選出煙草、水稻、首蓓、番茄、蘆葦?shù)戎参锏哪望}變異體并再生了植株[14]。玉米是一種對鹽分中度敏感的作物，選出具有分化能力高、耐鹽性的愈傷組織是篩選出耐鹽植株的關(guān)鍵。許多材料的愈傷組織或培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過長期的耐鹽篩選后，往往喪失再生植株的能力，本試驗(yàn)過程中也遇到了同樣的現(xiàn)象。NaCl濃度過低，不易篩選出耐鹽性較高的愈傷組織，同時也會造成過多的非轉(zhuǎn)化植株存活，增加后續(xù)轉(zhuǎn)化株的鑒定工作量[15-17]。相反NaCl濃度過高，會扼殺已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，篩選出的愈傷組織不能再生植株，且篩選頻率很低。為了獲得耐鹽再生植株，本試驗(yàn)采用了盡量減少耐鹽愈傷組織繼代次數(shù)和降低培養(yǎng)基中NaCl濃度等措施，取得了一定成效[18]。

本研究通過統(tǒng)計玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈傷組織在含有不同濃度NaCl及不同濃度2，4-D的篩選培養(yǎng)基上的愈傷存活率的情況，結(jié)果表明，當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L，2，4-D濃度為1.0 mg/L時玉米愈傷組織存活率最高，其中H99、丹988、丹598 3種基因型中H99的愈傷組織存活率最高。轉(zhuǎn)化玉米獲得轉(zhuǎn)BADH基因再生植株，陽性植株率達(dá)6.3%，對于其他相關(guān)因素還需進(jìn)一步的分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王麗燕，趙可夫. 玉米幼苗對鹽脅迫的生理響應(yīng)[J]. 作物學(xué)報，2005，31（2）：264-266.

[2] 王 寧.不同玉米品種苗期對鹽脅迫的生物學(xué)響應(yīng)及耐性機(jī)制研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] BIAN J，TANG J，LIN N.Relationship between saline-alkali soil formation and neotectonic move-ment in Songnen Plain，China[J].Environmental Geology，2008，55（7）：1421-1429.

[4] 李佐同，高聚林，王玉鳳，等.硅對NaCl脅迫下玉米幼苗生理特性的影響[J].玉米科學(xué)，2011（5）：73-76.

[5] ASHRAF M，SAEED M M. Effect of improved cultural practices on crop yield and soil salinity under relatively saline groundwater applications[J]. Irrigation and Drainage Systems，2006，20（1）：111-124.

[6] 胡笑形，羅 艷.2011年全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展概況[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品，2012，20（4）：17-18.

[7] 赫福霞，郎志宏，張 杰，等.轉(zhuǎn)Bt cry1Ah/2mG2-epsps雙價基因抗蟲/耐除草劑玉米研究[J]. 作物雜志，2012（6）：29-33.

[8] ARMSTRONG C L， GREEN C E. Establishment and maintenance of friable embryo genic maize callus and involvementofL-proline[J]. Planta，1985，164：207-214.

[9] REUTER H， MIDDLELHOFF U， GRAEF F， et al. Information system for monitoring environmental impacts of genetically modified organisms[J]. Environmental Science and Pollution Research，2010，17（8）：1479-1490.

[10] 邢 勇，張小冰，燕海梅，等.鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因玉米種子萌芽及幼苗生長的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（10）：19-21.

[11] 黃 璐，衛(wèi)志明.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報，1999，32（4）：381-378.

[12] 朱新廣，張其德，匡廷云.NaCl對小麥光合功能的傷害主要是由離子效應(yīng)造成的[J].植物學(xué)通報，2000，17（4）：360-365.

[13] 楊愛芳，姜素云，胡孝瑞，等.魯梅克斯離體培養(yǎng)及耐鹽植株的再生[J].草業(yè)學(xué)報，2005，14（2）：43-47.

[14] 尹祥佳，翁建峰，謝傳曉，等.玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用[J].作物雜志，2010（6）：1-9.

[15] SIDOROV V， GILBERTSON L， ADDAE P， et al. Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus[J]. Plant Cell Reports， 2006，25（4）：320-328.

[16] 王宏偉，梁業(yè)紅，史振聲，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].玉米科學(xué)，2011，19（3）：73-75.

[17] 蘇 金，朱汝財.滲透脅迫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)對植物抗旱耐鹽性的影響[J].植物學(xué)通報，2001，18（2）：129-136.

[18] 權(quán)瑞黨，尚 梅，張舉仁.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系愈傷組織轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2003，29（3）： 245-250.endprint