陸錚錚　蔣選利

摘要：從健康煙草根圍土壤中分離、篩選得到對煙草青枯病菌拮抗效果較好的放線菌和細菌。經鑒定兩株拮抗放線菌均屬鏈霉菌屬（Streptomyces），分別是綠色類群橄欖綠鏈霉菌（S. olivaceoviridis）、粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus）；拮抗細菌分別為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu）。在貴州省麻江縣煙田進行田間試驗，3次平均相對防效從大到小依次為粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌（63.65%）、球形賴氨酸芽孢桿菌（60.03%）、蠟樣芽孢桿菌（43.85%）、綠色類群橄欖綠鏈霉菌（41.76%）、40%硫酸鏈霉素（17.11%）。

關鍵詞：煙草青枯??；放線菌；細菌；田間試驗

中圖分類號：S435.72 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0087-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.022

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的煙草青枯病，又稱煙瘟、“半邊瘋”，素有植物“癌癥”之稱[1]。該病菌可以侵染50多個科的200多種植物[2]，傳播速度快，存活時間長[3]，造成的危害嚴重，給許多農作物帶來了巨大的傷害。目前對煙草青枯病的防治尚未有理想的藥劑，且抗病品種的應用也常受到自然條件的限制和抗性喪失等問題的困擾[4]。Cook等[5]和Chef[6]通過向土壤施加拮抗微生物來防治土傳病害，并取得了一定的防治效果。研究者認為生物防治在未來農業(yè)生產中具有重要地位。

前期研究分離了煙草根圍土壤中的微生物，通過平板對峙法篩選出了2株拮抗放線菌（平均抑菌圈直徑分別為43.20 mm、54.66 mm）和2株拮抗細菌（平均抑菌圈直徑分別為39.98 mm、48.88 mm）。2011年4月，選擇在貴州麻江杏山鎮(zhèn)麒麟村煙田中進行田間效果試驗，通過采用浸根、灌根的處理方法和3次病害調查的平均結果對田間效果進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試放線菌和細菌 選擇抑制效果最好的2株放線菌，分別為綠色類群橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis，編號為F4-3）、粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus，編號為F6-3），用燕麥液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成放線菌懸浮液。選擇抑制效果最好的2株細菌，分別為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，編號為C3-5）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu，編號為C5-3），用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成細菌懸浮液。

1.1.2 培養(yǎng)基[7] 液體燕麥培養(yǎng)基：燕麥片 30 g、水 1 000 mL；固體燕麥培養(yǎng)基：在液體燕麥培養(yǎng)基中加瓊脂 20～25 g；液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL；固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：在液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加瓊脂 20～25 g。

1.1.3 試區(qū)概況及供試品種 試驗在麻江縣杏山鎮(zhèn)麒麟村煙田中進行，海拔930 m，常年連作煙草，煙草青枯病發(fā)生嚴重，供試煙草品種為南江3號（中感青枯?。?。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液制備方法 用滅菌竹簽挑取放線菌在固體燕麥培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，用直徑為5 mm的打孔器打取放線菌的菌碟，取5個菌碟置于裝有300 mL液體燕麥培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)4 d可獲得放線菌懸浮液。

用接種環(huán)挑取細菌于5 mL的無菌水中，混勻。用移液槍吸取0.1 mL菌液分散地放于NA平板上，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，約20 min后，倒置于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，用直徑為5 mm的打孔器打取細菌的菌碟，取5個菌碟置于裝有300 mL NA液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于32 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)4 d后即可獲得細菌懸浮液。

1.2.2 田間設置 試驗共設6個處理，處理一：含F(xiàn)4-3；處理二：含F(xiàn)6-3；處理三：含C3-5；處理四：含C5-3；處理五：40%硫酸鏈霉素（2 000倍稀釋液，藥劑對照）；處理六：清水（空白對照）。每處理3個重復，共計18個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。每小區(qū)種有煙株82穴，每個小區(qū)之間和田邊都留出一行做為保護行。

2011年4月30日移栽煙苗，移栽前先用拮抗放線菌或細菌的液體培養(yǎng)液浸根40 min后再移栽，移栽完畢后，每株煙苗再用生防菌懸浮液40 mL+清水160 mL混合液澆根。之后每隔20 d澆灌1次，每株煙苗使用40 mL生防菌懸浮液澆灌，整個煙株生長期共澆灌3次。藥劑對照和空白對照的浸根、灌根時間、次數(shù)相同。于2011年6月30日處理完畢。

1.2.3 田間病害調查 以整株為單位，于2011年6月20日進行第一次調查，整個試驗階段共調查3次，間隔時間10 d。病害分級標準依據(jù)全國煙草行業(yè)煙草病害調查分級標準YC/T39-1996進行[8]。0級：全株無病；1級：莖部偶有退綠條斑，或（和）半數(shù)以下葉片或頂葉輕度凋萎；2級：莖部有明顯黑色條斑但尚未達到植株頂部，或（和）病側半數(shù)以上葉片或部分腰葉以上葉片凋萎；3級：莖部黑色條斑達到植株頂部，或病側葉片全部凋萎，或全株大部分葉片凋萎；4級：病株枯死。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析方法[9]

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=∑（各級病株或葉數(shù)×該病級值）/（調查總株或葉數(shù)×最高級值）×100endprint

相對防效=（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100%

采用Excel軟件計算發(fā)病率、病情指數(shù)、相對防效；DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析平均相對防效之間的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌、細菌田間試驗結果

第一次調查的時間為煙苗移栽后的50 d，之后每隔10 d調查一次，共調查3次。將這3次對煙草青枯病害調查的數(shù)據(jù)單獨統(tǒng)計，計算出3個重復小區(qū)的平均發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效。不同處理對煙草青枯病菌的防治效果見表1。由表1可知，①從2株放線菌的防治效果上看，與清水以及處理五相比，都表現(xiàn)為不同程度的防治作用。3次調查的結果都表明處理二的發(fā)病率始終是最低、病情指數(shù)最小、相對防效是最好的。②從2株細菌的防治效果上看，與清水以及處理五相比，也都表現(xiàn)為不同程度的防治作用。同樣3次調查的結果都表明處理四的發(fā)病率始終是最低、病情指數(shù)最小、相對防效是最好的。③從2株拮抗放線菌與2株拮抗細菌的防效對比上看，處理二的效果最好。則3次調查的相對防效平均值由大到小依次為處理二（63.65%）、處理四（60.03%）、處理三（43.85%）、處理一（41.76%）、處理五（17.11%）。④從處理五與清水處理對比上看，施用處理五的煙株，對煙草青枯病的防治略微有效，但是防效不明顯。⑤從不經過任何處理的對照組的數(shù)據(jù)上分析，其發(fā)病率隨時間推移越來越大，到了后期高達63.38%，這說明了該地塊的煙草青枯病發(fā)病非常的嚴重，損失相當?shù)拇蟆?/p>

2.2 相對防效的差異顯著性分析

由表2可知，試驗的4株生防菌中對煙草青枯病的防效與處理五相比均有極顯著差異。處理二與處理四3次調查表明沒有顯著或極顯著差異，但處理二的防效略高于處理四；處理一在第一次調查時防效極顯著高于處理三，但是另外兩次調查防效均沒有顯著差異。由此可知，防治效果由高到低依次是處理二 、處理四 、處理三、處理一、處理五。

綜上所述，2株拮抗放線菌和2株拮抗細菌的田間防治效果由大到小依次為F6-3、C5-3、C3-5、 F4-3。

3 小結與討論

1）采用平板對峙法篩選出的2株拮抗放線菌和2株拮抗細菌，不僅平板上的抑制效果明顯，且田間中的防治效果也顯著。其相對防效均明顯好于硫酸鏈霉素，且效果較穩(wěn)定。由此可見，煙草根圍土壤中的拮抗放線菌和拮抗細菌能夠較好地與病原菌競爭，從而達到防治病害發(fā)生的作用。特別是土壤中的鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬的菌株。

2）田間試驗效果表明，粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus，編號為F6-3）的防效最好。2株拮抗細菌也表現(xiàn)出較好的防治效果，且細菌的繁殖速度快，培養(yǎng)周期短。

3）本研究是對拮抗菌懸浮液的原液進行了田間測定，還需在不同的濃度梯度上進行試驗，進一步篩選出最佳的濃度，為提高這4種生防菌的利用價值提供出參考。

參考文獻：

[1] 張 薇.煙草青枯菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究[D]. 山東泰安：山東農業(yè)大學，2009.

[2] SALANOUBAT M， GENIN S，ARTIGUENAVE F，et al. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum[J].Nature，2002，415（6871）：497-502.

[3] GREY B E，STECK T R. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（9）：3866-3872.

[4] 霍沁建，張 深，王若焱.煙草青枯病研究進展[J].中國農學通報，2007，23（8）：364-368.

[5] COOK K J，BAKER K F. The nature and practice of biologicalcontrol of plant pathogens[M].USA：APS Press，1984.

[6] CHEF I. Innovative approaches to plant disease control[M].New York：Wiley，1987.

[7] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業(yè)出版社，1998.

[8] 孔凡玉，趙廷昌，張成省，等.防治煙草青枯病生防菌篩選及田間防治試驗研究[A].成卓敏.農業(yè)生物災害預防與控制研究[C].北京：中國農業(yè)出版社，2005.

[9] 陳敦德，熊尚玖，李宗友.農作物病蟲害統(tǒng)計方法及應用[M].成都：四川科學技術出版社，1989.endprint