胡祥龍，翟少東，曹 冰，楊 軍，張文佳，李 輝

(1．華南師范大學激光生命科學研究所，激光生命科學教育部重點實驗室，生物光子學研究院，廣東 廣州510631;2．中國科學技術大學，高分子科學與工程系，安徽 合肥510040)

0 引言

姜黃素(Curcumin)是從植物姜黃中分離得到的多酚類有機化合物，具有廣泛的藥用價值，如抗氧化、抗菌、抗炎以及抗腫瘤等［1］。在抗腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制多種腫瘤的生長增殖［2，3］，被用于放療［4，5］和化療［6，7］。但是其水溶性差，且在中性或者堿性條件下，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在體內(nèi)易被代謝，藥物的生物利用率低［8，9］，在pH=7．2條件下，其降解半衰期甚至不足十分鐘［10］。

針對上述問題，姜黃素的前藥研究越來越受到重視，但是普遍存在載藥量低等不足［11］。最近，我們設計了一種具有兩親性且含有藥物重復單元的功能高分子，即聚前藥兩親分子(Polyprodrug amphiphiles)，實現(xiàn)高載藥量(＞50 wt%)和多級納米結(jié)構(gòu)調(diào)控，并詳細研究其抗腫瘤納米結(jié)構(gòu)效應［12］;另外，也發(fā)展了具備腫瘤細胞穿膜和長血液循環(huán)特征的單分子超支化聚前藥兩親分子體系，用于抗腫瘤藥物傳輸和腫瘤醫(yī)學成像;實現(xiàn)在腫瘤細胞內(nèi)信號刺激下，藥物活性啟動，磁共振造影信號協(xié)同增強［13］。這些結(jié)果表明聚前藥兩親分子在抗腫瘤研究領域具有很好的應用和發(fā)展前景。

本工作中，我們將一種腫瘤酸性微環(huán)境可降解的共價鍵和親水功能團引入到姜黃素的聚前藥兩親分子設計中，可以很好地實現(xiàn)姜黃素在腫瘤細胞內(nèi)的輸運、釋放，并表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

1 實驗部分

1．1 試劑

二縮三乙二醇(Triethylene glycol)，3-溴丙炔(Propargyl bromide)，80% in toluene stabilized with MgO，Alfa Aesar)，3-巰基丙酸(Alfa Aesar)。對甲苯磺酰氯(TsCl)，疊氮化鈉(NaN3)，溴化亞銅，四正丁基碘化銨，草酰氯(Oxalyl chloride)，三乙胺購自國藥集團;姜黃素，五甲基二乙烯三胺(PMDETA)購自Aldrich;石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷，硫酸鎂，氨水，二甲亞砜，N，N-二甲基甲酰胺等溶劑均購自國藥集團。

1．2 儀器與表征

核磁共振譜(NMR)采用Bruker AV300核磁共振儀表征(共振頻率為300 MHz，CDCl3為氘代試劑)。透射電子顯微鏡(TEM)測試在JEOL 2010電子顯微鏡完成，加速電壓120 KV，樣品制備采用吸取10μL樣品溶液滴在Formvar薄膜和碳膜的銅網(wǎng)上，然后快速液氮冷卻，冷凍干燥以保持其在溶液態(tài)的形貌。紫外-可見光譜用Unico UV/vis 2802PCS紫外可見分光光度計測試。

2 結(jié)果與討論

圖1 姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)及其小分子前體合成Fig．1 Synthetic routes employed for curcumin-based polyprodrug amphiphiles，Poly(Cur-alt-TEG)and its small molecular precursors

2．1 1，2-bis(2-azidoethoxy)ethane(式1)的合成

將三甘醇(3 g，20 mmol)和對甲苯磺酰氯(8．580 g，45 mmol)溶于60 mL干燥CH2Cl2中，加入KOH(9．250 g，160 mmol)，冰水浴反應3小時。結(jié)束反應，加入60 mL水，用CH2Cl2萃取水相，無水硫酸鎂干燥有機相，過濾，濃縮除去溶劑，得到白色粉末狀固體(8．620 g，產(chǎn)率94．10%)。稱取該白色固體粉末(3．664 g，8 mmol)和NaN3(2．000 g，32 mmol)溶于20 mL DMF中，常溫反應過夜，經(jīng)過水洗，乙酸乙酯萃取，濃縮得到無色透明液體(1．315 g，產(chǎn)率82．2%)，其核磁氫譜表征如Fig．2a所示。

2．2 炔基功能化姜黃素(式4)制備

稱取3-巰基丙酸(1．592 g，15 mmol)，加入到32 mL氨 水 中(25%-28%)，攪 拌，加 入3-溴 丙 炔(3．569 g，30 mmol，80%儲存在甲苯中)，冰浴，反應40分鐘，濃縮，過濾，在濾液中加入飽和NaHCO3水溶液，用CH2Cl2萃取。取水相，用濃鹽酸酸化，用乙酸乙酯萃取。將油層分出，除去溶劑。再采用硅膠柱層析，用石油醚:乙酸乙酯=1∶3的淋洗劑，最后得到紅色液體(如圖1中的式2中間體，3-(prop-2-yn-1-ylthio)propanoic acid，1．570 g，產(chǎn)率72．7%)，其核磁氫譜表征如Fig．2b所示，結(jié)果表明成功制備式2中間體。

稱取中間體2(1．000 g，6．943 mmol)和草酰氯(3．328 mL，35．00 mmol)加入到經(jīng)干燥處理的30 mL CH2Cl2中，N2保護下反應過夜。除去溶劑，得到黃色液體，即成功將式2分子的羧基變成酰氯的中間體3(1．068 g，產(chǎn)率95%)。

最后，稱取姜黃素(0．500 g，1．357 mmol)和三乙胺(0．568 mL，4．072 mmol)加入到30 mL干燥的CH2Cl2中，冰浴。將中間體3(0．661 g，4．072 mmol)緩慢滴加到體系中，反應24 h。水洗，萃取有機相，并用無水硫酸鎂干燥。粗產(chǎn)物進行柱層析分離，淋洗劑為石油醚:二氯甲烷=1∶3，最后得到棕色固體，即炔基功能化姜黃素(如圖1式4所示，0．510 g，產(chǎn)率60．6%)。其核磁氫譜表征及峰的歸屬如圖2c所示，表明成功合成炔基功能化姜黃素前藥分子(如圖1中式4所示)。

圖2 姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)及其小分子前體的核磁共振氫譜表征Fig．2 1 H NMR spectra recorded for curcumin-based polyprodrug amphiphiles，Poly(Cur-alt-TEG)and its small molecular precursors

2．3 姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)的制備

如Fig．1所示，采用縮聚方法制備姜黃素聚前藥兩親分子，先將炔基功能化姜黃素(式4，124 mg，0．2 mmol)、疊氮化三甘醇(式4，42 mg，0．21 mmoL)和PMDETA(1．4 mg，0．01 mmol)溶于1．5 mL DMSO中，經(jīng)過凍融循環(huán)除去空氣，加入溴化亞銅(1．4 mg，0．01 mmol)，抽真空，50℃加熱反應48 h。結(jié)束后，采用乙醚沉淀，室溫干燥過夜。得到褐色固體(100 mg，27μmol，產(chǎn)率60．24%)。如Fig．2d所示，核磁共振氫譜中有明顯的點擊反應產(chǎn)物三氮唑的質(zhì)子信號，計算獲悉平均每條分子鏈上有5個三氮唑，再結(jié)合投料比疊氮基多于炔基、炔基基本沒有出現(xiàn)在核磁氫譜上，因此聚合物的結(jié)構(gòu)式可以表示為Poly(Cur4-alt-TEG5)，簡寫為Poly(Cur-alt-TEG)，數(shù)均分子量為2224，姜黃素的載藥量為66．2 wt%，如此高的載藥量在現(xiàn)有姜黃素藥物傳輸體系中是非常少見的［14］。

另外，采用紫外吸收光譜進一步驗證了姜黃素聚前藥兩親分子的成功制備;姜黃素的紫外吸收在～210 nm以及～430 nm，經(jīng)過改性以后，由于羥基和炔基等的吸電子性質(zhì)不同，430 nm處的吸收峰發(fā)生藍移，炔基化姜黃素前體的紫外吸收在210 nm以及400 nm處，同樣，Poly(Cur-alt-TEG)在210 nm和400 nm處都有強吸收。因此，從吸收峰的位置說明姜黃素前體成功聚合，且制備過程中沒有降解釋放姜黃素，具有較好的穩(wěn)定性。

2．4 Poly(Cur-alt-TEG)膠束納米粒子的制備與表征

由于Poly(Cur-alt-TEG)中三甘醇親水基元的存在，因此其具有兩親性。本文采用“自下而上”的自組裝策略來制備姜黃素聚前藥兩親分子的水相納米粒子，先稱取2．0 mg Poly(Cur-alt-TEG)聚合物，溶解在1．0 mL DMSO中，隨后在快速攪拌下，快速注入水中，繼續(xù)攪拌3 h，然后轉(zhuǎn)移到透析袋中對水透析除去有機溶劑，多次換水，即可制得姜黃素聚前藥兩親分子的水相納米粒子，進行濃度標定，并用于后續(xù)測試。采用TEM對膠束納米粒子進行了表征，如Fig．3b所示，納米粒子的平均直徑約為46 nm，抗腫瘤藥物傳輸納米粒子的尺寸一般不超過200 nm會更加有利，因此，姜黃素藥物傳輸體系的尺寸滿足腫瘤治療的要求［14］。

2．5 抗腫瘤活性評價

選用HepG 2細胞系，通過MTT法檢測姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)納米粒子的抗癌活性。將細胞接種在96孔板上，每個孔加100μL培養(yǎng)基，初始密度約為每孔80 000個細胞，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁，再用換取新鮮的培養(yǎng)基替代，分別加入姜黃素和Poly(Cur-alt-TEG)的組裝體培養(yǎng)48 h。另設細胞空白對照組和培養(yǎng)基空白組，每孔設5復孔。每孔加入20μL MTT試劑(PBS溶液，5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，吸出DMEM培養(yǎng)基，加入180μL DMSO，酶標儀檢測570 nm的吸光度值(A)。每次實驗條件均采集四組數(shù)據(jù)，所得到的最終數(shù)據(jù)是四組平行試驗的平均值及標準偏差(±SD)，以培養(yǎng)基空白組調(diào)零，計算細胞存活率。如圖4所示，Poly(Cur-alt-TEG)與姜黃素小分子藥物對腫瘤細胞的毒性接近，說明姜黃素的聚前藥兩親分子在改善藥物的溶解性的同時并沒有使其喪失藥效;這與聚前藥兩親分子的分子結(jié)構(gòu)有關，如Fig．1所示，本文采用巰基丙酸酯鍵連接姜黃素構(gòu)成分子骨架，而該鍵在微酸性環(huán)境中會發(fā)生降解［15］，即納米粒子進入腫瘤細胞以后，在腫瘤的酸性細胞器內(nèi)發(fā)生降解，釋放出姜黃素原藥分子，表現(xiàn)出抗腫瘤活性［16］。

圖3 (a)姜黃素，炔基功能化姜黃素以及姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)的紫外吸收光譜;(b)姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)的自組裝納米粒子透射電鏡圖Fig．3 (a)UV-vis absorption spectra for curcumin，alkynyl-functionalized curcumin，and Poly(Cur-alt-TEG);(b)TEM image recorded for nanoparticles fabricated from the aqueous self-assembly of Poly(Cur-alt-TEG)

圖4 不同濃度姜黃素聚前藥兩親分子Poly(Curalt-TEG)和姜黃素與HepG2細胞共培養(yǎng)48 h的細胞活性Fig．4 Cell viability analysis determined by MTT assay for HepG2 cells upon incubation with aqueous dispersion of Poly(Cur-alt-TEG)and curcumin at different equivalent dosages

3 結(jié)論

近年來，姜黃素的抗腫瘤研究越來越受到關注，但其水溶性和穩(wěn)定性限制了其應用?；诰矍八巸捎H分子在抗腫瘤研究中的重要優(yōu)勢，本文利用縮聚反應制備了姜黃素的聚前藥兩親分子Poly(Cur-alt-TEG)，載藥量高達66．2%。通過水相自組裝調(diào)控，制備球狀納米粒子，粒徑約為46 nm。細胞生物學評價表明，該姜黃素藥物傳輸系統(tǒng)對HepG2細胞具有較好的殺傷效果。本文研究表明姜黃素聚前藥兩親分子在腫瘤治療領域具有重要應用前景，為未來姜黃素藥物傳輸體系設計提供了重要參考。

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