呂錦芳，饒開晴，姜錦鵬，倪迎冬，顧有方，寧康健，應如海，周玉剛，許百年

(1．安徽科技學院，安徽 鳳陽233100;2．西南民族大學，四川 成都610041;3．南京農業(yè)大學農業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京210095;4．安徽省蚌埠市畜牧獸醫(yī)技術推廣站，安徽 蚌埠233000)

至今的研究普遍認為，動物生殖能力的獲得和維持稱為性成熟，而性成熟的啟動有賴于下丘腦－垂體－性腺軸的成熟。家禽的性成熟主要受基因型、營養(yǎng)和光照等因素的影響，并且育成雞性成熟的速度受光照、營養(yǎng)等因素單獨影響或協(xié)同影響而加快。早期研究已證實家雞性成熟日齡與育成期光照長度呈負相關關系［1］。促性腺激素釋放激素(GnRH)是下丘腦分泌的重要信息分子，系生殖軸的上游激素，性成熟的限速因子［2］，脈沖形式分泌引起黃體生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)釋放作用于性腺。促性腺激素釋放激素受體(GnRH－R)是介導GnRH功能必不可少的物質，主要分布于垂體，20世紀70年代后下丘腦－垂體軸外GnRH及GnRH－R也相繼被發(fā)現(xiàn)［3］。至今有關光周期對蛋雞生殖軸GnRH mRNA與GnRH－RmRNA的表達與卵巢發(fā)育變化的關系報道還較少，本文通過光控觀察了育成蛋雞下丘腦－垂體GnRH－I及GnRH－RamRNA表達的變化以及對卵巢發(fā)育的調控功能，為進一步探討蛋雞生殖軸的發(fā)育和成熟的影響因素，提高蛋雞的生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗雞

75日齡ISA褐蛋雞60只，隨機均分成長光和短光兩組，正式試驗期70天(75～145日齡)。短光組(簡稱SL)，恒定光/暗:8 h/16 h;長光組(簡稱LL)，起始光/暗:8 h/16 h，以后每周增加0．5h，最長光/暗達到13 h/11 h，以短光組雞群見蛋日(145日齡)結束試驗。地面平養(yǎng)，自由采食飲水，常規(guī)免疫。記錄每組試驗始重，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異不顯著。分別于105 d和136 d(長光組約10%開產(chǎn))每組隨機各取蛋雞6羽稱重并斷頸處死，迅速無菌取出下丘腦、垂體置液氮速凍，－70℃凍存，并仔細分離卵巢稱重。

表1 引物參數(shù)Tab．1 Primer parameters

1．2 主要儀器和試劑

生物分光光度計(德國eppendorf)，普通PCR儀(美國BIO RAD公司)，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(Kodak 1D Electrophoresis Documentation and Analysis System 120)。TRIzol總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN)，M－MLV、RNAase抑 制 劑(美 國Promega公司)，Taq DNA聚合酶及PCR試劑(大連TaKaRa公司)等。

1．3 引物合成

由GenBank檢索雞的GnRH－I DNA序列，GnRHRaDNA序列，Beta－actinDNA序列，使用Primer premier 5．0軟件跨內含子設計引物序列，GnRH－Ra引物序列參考［4］，委托皓嘉生物技術有限公司合成，見表1。

1．4 檢測指標及分析方法

測定育成蛋雞105 d和136 d的體重、卵巢重和卵巢指數(shù)。下丘腦組織GnRH－ⅠmRNA和垂體組織GnRH－RamRNA的表達，采用RT－PCR方法，以常用管家基因β－肌動蛋白(Beta－actin)為內源性內標，對GnRH－I和GnRH－Ra的表達產(chǎn)物mRNA進行相對定量。

卵巢指數(shù)(mg/g)=卵巢鮮重(mg)/蛋雞空腹活重(g)

1．5 RNA提取和反轉錄

利用Trizol試劑提取下丘腦及垂體組織的總RNA，生物分光光度計測定總RNA濃度和純度(OD260/OD280=1．8～2．0)。采用甲醛凝膠變性電泳方法，檢查所提取的總RNA的完整性;PCR試劑檢查有無外源污染。使用隨機引物對總RNA進行反轉錄(RT)，建立樣品的cDNA第一鏈。反應體系為25μL:MixⅠ包括RNA 2μg，隨機引物1μg，10 mmol/L dNTP 2μL，DEPC水補足12μL，70℃預變性5 min，立即冰浴，繼而加入反轉錄Mix II，包括M－MLV反轉錄酶100 U，RNAase抑制劑8 U，5×RT Buffer 5 μL(含 250 mmol/L Tris－HCl pH8．3，15 mmol/L MgCl2，375 mmol/L KCl，50 mmol/L DTT)，DEPC水補足25μL，混勻后37℃反應60 min，95℃滅活5 min，4℃取樣。并將所有樣品的總RNA重復反轉錄，建立樣品的兩套cDNA。

1．6 PCR反應及產(chǎn)物

下丘腦目的基因GnRH－Ⅰ的PCR的優(yōu)化條件:反應體系25μL，其中RT產(chǎn)物2μL，加入PCR混合液23μL(10 pmol/μL GnRH－I上、下游引物各0．5 μL，10 pmol/μL Beta－actin上、下游引物各0．5μL，各2．5 mmol/L dNTP 0．5μL，25 mmol/L MgCl22．0μL，5 U/μL TaqE 0．1μL，10×PCR Buffer 2．5μL，ddH2O 15．9μL)。PCR擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共28個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃取樣。垂體目的基因GnRH－Ra的PCR的優(yōu)化條件:反應體系25μL，其中RT產(chǎn)物2μL，加入PCR混合液23μL(10 pmol/μLGnRH－Ra上、下游引物各1μL，10 pmol/μL Beta－actin上、下游引物各0．85μL，10×PCR Buffer 2．5μL，25 mmol/L MgCl21．5μL，各2．5 mmol/L dNTP 2．0μL，5 U/μL TaqE 0．15μL，ddH2O 13．15μL)。PCR擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃10 s，65℃20 s，74℃30 s，31個循環(huán);74℃延伸10 min。以上目的基因的兩套RT產(chǎn)物cDNA分別進行PCR擴增，以比較兩套RT產(chǎn)物擴增趨勢的一致性。

PCR產(chǎn)物加入Loading buffer 2μL混勻，取18μL在EB染色的2．0%瓊脂糖凝膠上進行電泳。電泳結果的圖像處理及灰度分析在Kodak 1D Electrophoresis Documentation and Analysis System 120(日本)上進行。用GnRH－I mRNA(GnRH－Ra)灰 度/Beta－actinmRNA灰度表示蛋雞生殖軸目的基因的表達水平，并用兩套灰度比的均值用于統(tǒng)計分析。

1．7 測序

雞下丘腦GnRH－I(Genbank:X69491，跨內含子)設計的引物特異性已測序鑒定［5］，GnRH－RaPCR產(chǎn)物的序列分析由大連TaKaRa公司完成。使用Blast程序將測序結果與登錄的雞垂體GnRH－Ra(Genbank:AJ304414，跨內含子)序列進行同源性比較。

1．8 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2．1 卵巢發(fā)育

由表2可見，試驗至105 d，短光組的體重、卵巢重以及卵巢指數(shù)與長光組均沒有差異(P＞0．05)。136 d時短光組的體重低于長光組，但差異不顯著(P＞0．05)，而卵巢重、卵巢指數(shù)極顯著低于長光組(P＜0．01)。

2．2 下丘腦GnRH－I mRNA的表達

105 d長光組下丘腦GnRH－I mRNA的表達豐度高于短光組，但差異不顯著(P＞0．05)。136 d長光組GnRH－I mRNA的表達豐度顯著高于短光組(P＜0．05)，且極顯著高于105 d長光組和短光組的表達(P＜0．01)。該結果提示育成蛋雞在開產(chǎn)(長光組)或開產(chǎn)前(短光組)，下丘腦的GnRH－I mRNA表達均處于升勢，且長光組開產(chǎn)時達到相對較高水平，見圖1。

表2 育成蛋雞卵巢發(fā)育的比較±SE)Tab．2 Comparison of ovary development in growing layers

表2 育成蛋雞卵巢發(fā)育的比較±SE)Tab．2 Comparison of ovary development in growing layers

日齡(d)Day old 105 136光周期Photoperiods LL SL LL SL體重(g)Body weight 1289．667±49．007 1279．333±57．553 1608．667±56．526 1476．833±37．637卵巢重(g)Ovary weight 0．613±0．047 0．662±0．052 34．783±4．825 1．417±0．400＊＊卵巢指數(shù)(mg/g)Ovary index 0．474±0．025 0．520±0．042 21．900±3．372 0．946±0．247＊＊

圖1 下丘腦GnRH－I mRNA表達分析Fig．1 Analysis of GnRH－I mRNA expression in hypothalarmus

2．3 垂體GnRH－Ra mRNA的表達

105 d，長光組垂體GnRH－RamRNA的表達豐度與短光組沒有差異(P＞0．05)。136 d短光組GnRHRamRNA表達較105 d顯著下降(P＜0．05)，長光組GnRH－RamRNA表達的豐度顯著高于短光組(P＜0．05)，并且與105 d的長光組和短光組的表達均沒有差異(P＞0．05)。該結果提示長光處理，蛋雞在開產(chǎn)前垂體GnRH－RamRNA的表達始終處于微弱的升勢，但136 d時短光明顯下調了GnRH－RamRNA的表達，見圖2。

圖2 垂體GnRH－Ra mRNA表達分析Fig．2 Analysis of GnRH－Ra a mRNA expression in pituitary

2．4 垂體GnRH－Ra核苷酸序列分析

蛋雞垂體GnRH－RacDNA基因擴增片斷的序列(簡稱Sbjct)與GenBank檢索雞的GnRH－RacDNA(AJ304414，簡稱Query)部分序列比對吻合率達到98%，見圖3。

3 討論

禽類GnRH均為十肽激素存在兩種類型:cGn－RH－I和cGnRH－II。cGnRH－II與cGnRH－I有3個氨基酸差異。哺乳動物體內也存在兩種或兩種以上類型GnRH(mammalian GnRH，mGnRH)，其下丘腦脈沖式分泌的mGnRH為十肽激素，與禽類的cGnRH－I僅第八位氨基酸差異。Dunn等［6］認為，cGnRH－II不可能促進鳥類促性腺激素的釋放，原因包括:cGnRHII不存在于正中隆起，其胞體存在于下丘腦的動眼區(qū)域，而cGnRH－I胞體主要位于下丘腦視前區(qū)［7，8］。因此，cGnRH－I通過垂體門脈與垂體前葉促性腺細胞表面的特異性高親和力GnRH－R結合，促進FSH、LH的合成與分泌。研究顯示，小公雞青春期啟動過程中，下丘腦cGnRH－I的含量增加［9］，并且6周齡小公雞下丘腦前葉GnRH的陽性細胞數(shù)量顯著多于3周齡小公雞［10］。肉用蛋雞產(chǎn)蛋啟動前3周下丘腦的正中隆起GnRH－I含量明顯升高，且16周齡后垂體LH和FSH含量與下丘腦正中隆起cGnRH－I水平呈正相關［11］。證實禽類在性成熟過程中下丘腦GnRH神經(jīng)元經(jīng)歷了成熟性變化的過程，而cGnRH－II可能通過調控cGnRH－I的功能而間接影響促性腺激素的釋放和功能。促性腺激素抑制激素(GnIH)通過一種新的G蛋白偶聯(lián)受體(GPR147)作用于垂體和下丘腦GnRH神經(jīng)元，GnIH能夠減少促性腺激素的合成和釋放，抑制性腺發(fā)育和維持［12］。本試驗測得，105 d和136 d長光、短光組下丘腦GnRH－I mRNA的表達均處于上升趨勢，且136 d長光組GnRH－I mRNA表達豐度顯著高于短光組，也極顯著高于105 d長光組和短光組的表達。提示開產(chǎn)前夕長光大幅度上調了GnRH－I mRNA表達水平，與以上肉用蛋雞產(chǎn)蛋啟動前3周下丘腦的正中隆起GnRH－I含量明顯升高是基本一致的。

圖3 垂體GnRH－Ra cDNA的同源性比對結果Fig．3 Comparison of GnRH－Ra cDNA homology in pituitary

動物的GnRH－R基因和人的基本相同，哺乳動物GnRH－R序列具有80%以上的同源性，都被歸類為GnRH－I型受體。由于I型受體可以高親和力結合GnRH－II，所以可取代GnRH－II型受體的作用，反過來就不行，因為GnRH－II型受體對GnRH－II具有高度選擇性，但鳥類的繁殖狀況與垂體GnRH－II全長的mRNA水平相關，而它的剪接變異體mRNA的表達在大多數(shù)腦組織檢測到［13］。研究表明，除動物的垂體存在GnRH－RmRNA表達外，在雞的下丘腦［4］、大鼠的卵巢［14］，以及人的非生殖器官等也存在Gn－RH－RmRNA的表達［3］。GnRH結合GnRH－R，引起受體構象的改變，向細胞內轉導信號，但持續(xù)給予GnRH或GnRH類似物，可造成垂體GnRH－R的下調和脫敏，導致垂體－性腺軸功能抑制［15］。然而調節(jié)卵巢發(fā)育的內分泌機制較為復雜，研究顯示小卵泡顆粒細胞中瘦素(LEP)的表達遠高于大卵泡，而大卵泡分離的顆粒細胞中瘦素受體(LEP－Rb)的表達高于小卵泡的顆粒細胞，提示卵巢瘦素信號系統(tǒng)的存在對卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟發(fā)揮潛在的調節(jié)作用［16］。同樣生長激素受體(GH－R)等也廣泛地分布在大部分雞的生殖系統(tǒng)，調節(jié)生殖組織的生長發(fā)育和功能的變化［17］，從而影響卵巢的發(fā)育。試驗測得，長光組在開產(chǎn)前四周垂體的GnRH－RamRNA表達仍然處于微弱的升勢，這與下丘腦GnRH－I mRNA的表達上調并保持升勢是完全一致的，但短光組開產(chǎn)前40天垂體GnRH－RamRNA的表達已進入下調通道，136 d其GnRH－RamRNA的表達豐度顯著低于長光組，提示短光下調了開產(chǎn)前蛋雞垂GnRH－RamRNA的表達。105 d光處理蛋雞的體重、卵巢重以及卵巢指數(shù)均沒有差異，136 d時長光組的卵巢重、卵巢指數(shù)極顯著高于短光組。卵巢發(fā)育的差異同時伴隨出現(xiàn)見蛋日的差異(LL131 d/SL145 d)。綜上所述，長光明顯上調開產(chǎn)前蛋雞下丘腦GnRH－I mRNA的表達，其GnRH－RamRNA的表達也保持較高的水平促進卵巢的發(fā)育，而短光則明顯下調垂體GnRHRamRNA的表達，這也可能是其卵巢發(fā)育延緩的主要原因之一。

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