馬淑燕，許利耕

(1．蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，江蘇蘇州215123;2．蘇州大學(xué)功能納米與軟物質(zhì)研究院，江蘇蘇州215123)

目前臨床上疫苗多采用減毒或滅活的病毒/細(xì)菌作為載體，然而其潛在的安全性問(wèn)題限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，DNA疫苗由于生產(chǎn)成本低、安全性好，可同時(shí)攜帶多種抗原且能同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，逐漸成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1］。然而，由于裸DNA很難進(jìn)入機(jī)體且極易被核酸酶降解，從而嚴(yán)重影響了其免疫原性［2］。因此，研究開發(fā)出安全、有效的疫苗載體或佐劑成為目前亟待解決的問(wèn)題。

相對(duì)于病毒載體，非病毒載體具有更好的安全性。近年來(lái)，由于納米技術(shù)的飛速發(fā)展，作為非病毒載體，納米材料由于其易于合成和加工修飾、可促進(jìn)功能分子進(jìn)入細(xì)胞等特點(diǎn)而越來(lái)越受到人們的關(guān)注。理想的疫苗佐劑應(yīng)該具有增強(qiáng)抗原的免疫原性;可同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫反應(yīng);生物可降解、經(jīng)濟(jì)且易于制備等特點(diǎn)。鋁佐劑和MF59是目前公認(rèn)的可用于人體的2種疫苗佐劑，然而這2種佐劑均難以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)［3］。同時(shí)，鋁佐劑可導(dǎo)致注射部位炎癥反應(yīng)的發(fā)生且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)［4］。相對(duì)于鋁佐劑，磷酸鈣具有更多優(yōu)勢(shì)，如生物可降解、對(duì)注射部位無(wú)刺激等。歐洲一些國(guó)家已批準(zhǔn)磷酸鈣作為佐劑應(yīng)用于人體［5］。磷酸鈣顆粒的合成方法主要包括共沉淀法［6］和反向微乳液法［7－10］等。然而，共沉淀法制備的磷酸鈣顆粒粒徑較大且分布較寬，造成了其功能方面如基因轉(zhuǎn)染效率較低，重復(fù)性差［11］。反向微乳液法制備的磷酸鈣顆粒尺寸可控性好，但產(chǎn)量較低，從而也在一定程度上限制了其在臨床上的廣泛使用。He等［12－13］利用檸檬酸鈉與鈣離子的螯合作用，在共沉淀反應(yīng)過(guò)程中引入檸檬酸鈉，合成了一種磷酸鈣納米顆粒，發(fā)現(xiàn)與鋁佐劑相比其可顯著促進(jìn)HSV-2蛋白質(zhì)抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生更高效價(jià)的抗體且對(duì)注射部位無(wú)刺激作用。同時(shí)，該磷酸鈣納米顆?？纱碳C(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，因此其可作為潛在的黏膜免疫佐劑保護(hù)機(jī)體免受病毒的感染。然而，該磷酸鈣納米顆粒是否可作為疫苗載體或佐劑提高DNA抗原的免疫原性則尚不清楚。筆者旨在通過(guò)評(píng)價(jià)該磷酸鈣納米顆粒的基因轉(zhuǎn)染能力，從而初步確定其是否可作為一種潛在的DNA疫苗載體或佐劑。

1 材料與方法

1．1 材料 293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA(pEGFP)購(gòu)于美國(guó)Clontech公司;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;胎牛血清購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司，氯化鈣、磷酸二氫鈉、檸檬酸三鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

瓊脂糖凝膠電泳儀和凝膠成像儀購(gòu)于北京六一生物科技有限公司;磁力攪拌器購(gòu)于德國(guó)IKA公司;倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯株式會(huì)社;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)BioRad公司;流式細(xì)胞儀(BD Calibur)購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1．2 方法

1．2．1 磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復(fù)合物的制備與表征。將7．5 ml氯化鈣水溶液(12．5 mmol/L)加入玻璃瓶中，置于磁力攪拌器上。并在攪拌過(guò)程中，緩慢滴加7．5 ml磷酸二氫鈉水溶液(12．5 mmol/L)。向上述混合物中緩慢滴加1．5 ml檸檬酸鈉水溶液(15．6 mmol/L)，繼續(xù)攪拌約12 h。14 800 r/min，離心15 min。同時(shí)，將沉淀分散于1 ml去離子水中，利用馬爾文激光粒度儀對(duì)其粒徑和電勢(shì)進(jìn)行表征［12－13］。

1．2．2 磷酸鈣納米顆粒的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。設(shè)空白對(duì)照組(即培養(yǎng)基處理組)和磷酸鈣納米顆粒處理組。以0．25%胰酶消化293T細(xì)胞，終止消化后，以1 000 r/min，離心5 min。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，并以5×104/ml濃度接種于96孔板中，每孔100μl。置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，棄去培養(yǎng)基，分別加入新鮮完全培養(yǎng)基和不同濃度梯度的磷酸鈣納米顆粒，磷酸鈣納米顆粒的工作濃度為 6．25、12．50、25．00、50．00和100．00μg/ml，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h。棄去培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌2～3次。每孔加入120μl含適當(dāng)濃度MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，每孔加入150μl二甲基亞砜，置于搖床上，避光條件下，低速振蕩10 min。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)吸光度，確定磷酸鈣納米顆粒的細(xì)胞毒性。

1．2．3 磷酸鈣納米顆?；蜣D(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)。參照“1．2．1”方法制備磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復(fù)合物。具體方法:將100μg pEGFP質(zhì)粒DNA溶于7．5 ml氯化鈣水溶液(12．5 mmol/L)加入玻璃瓶中，置于磁力攪拌器上。之后與“1．2．1”中所述方法完全相同，分別加入磷酸二氫鈉和檸檬酸鈉，反應(yīng)12 h后，14 800 r/min，離心15 min。取上清，利用核酸分析儀檢測(cè)上清中游離質(zhì)粒DNA的含量，從而確定磷酸鈣納米顆粒包裹DNA的效率。同時(shí)，將沉淀分散于1 ml無(wú)菌水中，最終獲得磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復(fù)合物(CAPNP-pEGFP)。

參照“1．2．2”方法，將293T 細(xì)胞懸液以5 ×104/ml濃度接種于24孔板中，置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。棄去培養(yǎng)基，分別加入含游離pEGFP和磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復(fù)合物的完全培養(yǎng)基，pEGFP的工作濃度均為3μg/ml，繼續(xù)孵育48 h。利用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別評(píng)價(jià)磷酸鈣納米顆粒的基因轉(zhuǎn)染能力。

2 結(jié)果與分析

2．1 磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復(fù)合物的制備與表征 激光粒度儀的表征結(jié)果顯示，磷酸鈣納米顆粒的平均水合粒徑為692．6 nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為0．149，粒徑分布狹窄，表面電勢(shì)為－11．1 mV(圖1)。鈣離子可通過(guò)與DNA螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)的磷酸根形成復(fù)合物［14］，因此磷酸鈣納米顆?？稍诔恋矸磻?yīng)過(guò)程中包裹質(zhì)粒DNA即pEGFP。根據(jù)公式:

包裹效率(%)=(DNA總量－上清中游離DNA)/DNA總量×100

利用核酸分析儀，可以確定磷酸鈣納米顆粒對(duì)pEGFP的平均包裹效率為15．5%。總DNA與上清中游離DNA的電泳結(jié)果則進(jìn)一步證明(圖2)，部分pEGFP可被磷酸鈣納米顆粒成功包裹起來(lái)。

2．2 磷酸鈣納米顆粒的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 對(duì)磷酸鈣納米顆粒的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，當(dāng)材料處理細(xì)胞48 h，即使在高濃度(100μg/ml)，磷酸鈣納米顆粒依然未顯示出對(duì)293T細(xì)胞明顯的毒性作用，細(xì)胞活力仍在80%左右(圖3)。

2．3 磷酸鈣納米顆粒的基因轉(zhuǎn)染能力評(píng)價(jià) 由圖4和圖5可知，磷酸鈣納米顆粒可顯著提高pEGFP質(zhì)粒DNA對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力。這主要是由于游離DNA即pEGFP質(zhì)粒DNA很難進(jìn)入細(xì)胞且易被核酸酶降解，其對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力很弱。而當(dāng)磷酸鈣納米顆粒將其包裹后，可有效促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)保護(hù)其免受酶的降解。這意味著作為DNA疫苗載體，磷酸鈣納米顆?？赏ㄟ^(guò)包裹DNA抗原，保護(hù)其免受降解，且促進(jìn)其被組織細(xì)胞尤其是免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞攝 取，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞，提高抗原的免疫原性。

3 討論

該研究采用He等［12－13］合成磷酸鈣納米顆粒的方法，成功制備了粒徑分布狹窄的磷酸鈣納米顆粒，其對(duì)細(xì)胞未顯示出明顯的毒性作用，而且可有效促進(jìn)pEGFP質(zhì)粒DNA對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。這表明該磷酸鈣納米顆?？赡茏鳛镈NA疫苗的載體或佐劑，進(jìn)一步提高抗原的免疫原性。下一步將對(duì)磷酸鈣納米顆粒與免疫細(xì)胞尤其是抗原呈遞細(xì)胞的相互作用，及其在動(dòng)物試驗(yàn)水平是否具有疫苗載體或佐劑的功能進(jìn)行系統(tǒng)地研究。

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