馬 帥，葛潔英，周 蓬

（1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東淄博255086；2.安丘市魯安藥業(yè)有限責(zé)任公司，山東安丘262100）

HPLC法測(cè)定白帶丸中芍藥苷及鹽酸小檗堿的含量

馬 帥1，葛潔英2，周 蓬1

（1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東淄博255086；2.安丘市魯安藥業(yè)有限責(zé)任公司，山東安丘262100）

目的建立以高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定白帶丸中芍藥苷及鹽酸小檗堿含量的方法。方法 色譜柱為Wondasil C18Superb（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈－0.3%磷酸溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min－1，芍藥苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，鹽酸小檗堿的檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。結(jié)果芍藥苷與鹽酸小檗堿分別在0.106 29～2.125 8μg·mL－1（r＝0.999 9）與0.060 21～1.204 2μg·mL－1（r＝0.999 9）濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；平均回收率為98.45%與100.52%。結(jié)論本方法可用于白帶丸的質(zhì)量控制。

白帶丸；芍藥苷；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

白帶丸由黃柏（酒炒）、椿皮、白芍、當(dāng)歸、香附5味藥組成，有清熱、除濕、止帶的功效，自1977年以來(lái)，一直為《中國(guó)藥典》所收載?！吨袊?guó)藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)中，其檢驗(yàn)項(xiàng)目為HPLC法測(cè)定鹽酸小檗堿的含量［1］。而方中白芍含有的有效成分芍藥苷也可用于該藥的質(zhì)量控制［2］。為了控制白帶丸的質(zhì)量，保證其療效，采用HPLC法對(duì)白帶丸中芍藥苷、鹽酸小檗堿成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，樣品處理簡(jiǎn)單。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AT高效液相色譜儀，SPD－20A UV／VIS檢測(cè)器（日本島津公司）；Mettler AE240電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；KS－ 300E超聲波清洗機(jī)（寧波科生儀器廠）。

1.2 試藥 芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736－201035）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713－200910）；樣品為白帶丸（河北萬(wàn)歲藥業(yè)有限公司，批號(hào)為：130103、130409；山東孔圣堂制藥有限公司批號(hào)：20806）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Wondasil C18Superb（4.6 mm×250 mm，5μm），流速：1.0 mL·min－1，柱溫：40℃，以乙腈為流動(dòng)相A，0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)0～12 min，230 nm；12～23 min，320 nm；23～35 min，230 nm，結(jié)果見(jiàn)表1。。在此色譜條件下，理論板數(shù)按芍藥苷、鹽酸小檗堿計(jì)算均不低于4 000。

表1 梯度洗脫順序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷（11.20 mg）、鹽酸小檗堿（12.30 mg），加甲醇制成每1 mL分別含芍藥苷106.29μg、鹽酸小檗堿60.21μg的混合溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，精密加入鹽酸－50%甲醇（1∶100）混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（500 W，40 kHz），放冷，用鹽酸－50%甲醇（1∶100）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［1］。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除白芍、黃柏外的其他藥味，按白帶丸制備方法制成陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在供試品色譜峰與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間的位置上，供試品有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 白帶丸測(cè)芍藥苷及鹽酸小檗堿HPLC圖A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性對(duì)照樣品 1.芍藥苷；2.鹽酸小檗堿

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，芍藥苷回歸方程為：Y＝1 489 931X＋6 014，r＝0.999 9；鹽酸小檗堿回歸方程為：Y＝549 986X＋14 100，r＝0.999 9。結(jié)果表明芍藥苷在0.106 29～2.125 8μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，鹽酸小檗堿在0.060 21～1.204 2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果芍藥苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.26%、0.62%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：130103）樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果芍藥苷及鹽酸小檗堿含量的平均值（n＝6）分別為4.38、4.40 mg·g－1，RSD分別為1.5%、1.9%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，置室溫下放置，分別在0、2、4、8、16、24 h各進(jìn)樣10μL，測(cè)定芍藥苷、鹽酸小檗堿色譜峰峰面積RSD分別為0.39%、0.36%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的本品（批號(hào)：130103，芍藥苷及鹽酸小檗堿含量分別為4.38、4.40 mg·g－1）供試品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對(duì)照品溶液5 mL及鹽酸－50%甲醇（1∶100）20 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定芍藥苷及鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算平均回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 芍藥苷的加樣回收結(jié)果

表3 鹽酸小檗堿的加樣回收結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 芍藥苷、鹽酸小檗堿分別在230、320 nm處有最大吸收，采用單波長(zhǎng)不能兼顧這兩種成分的檢測(cè)，選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)模式。

3.2 提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間的選擇 比較了超聲提取法和加熱回流法，兩種方法提取效率相當(dāng)，但超聲提取法操作簡(jiǎn)單；考察了以甲醇，50%甲醇，鹽酸－50%甲醇（1∶100）混合溶液為提取溶劑［3～10］，結(jié)果鹽酸－50%甲醇（1∶100）混合溶液提取效果較好；考察了超聲提取15、30、45、60 min，實(shí)驗(yàn)表明超聲提取30 min后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量無(wú)明顯差別。故確定以鹽酸－50%甲醇（1∶100）混合溶液為提取溶劑，超聲提取30 min。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)通過(guò)選用不同溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，分別采用乙腈－水、乙腈－0.3%磷酸溶液等作為流動(dòng)相［3～10］，結(jié)果表明，乙腈－0.3%磷酸溶液峰形好，基線較穩(wěn)定。同時(shí)，為解決芍藥苷與鹽酸小檗堿的分離問(wèn)題，選擇梯度洗脫程序，同時(shí)也大大縮短分析時(shí)間。因此選擇乙腈－0.3%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 小結(jié) 采用雙波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定白帶丸中芍藥苷、鹽酸小檗堿的含量，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于該制劑質(zhì)量控制的依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：655－656.

［2］ 鄧君麗，梁洪華.HPLC法測(cè)定白帶丸中芍藥苷的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（3）：205－206.

［3］ 張玲容.HPLC測(cè)定白帶丸中鹽酸小檗堿的含量［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（4）：905－906.

［4］ 師永清，康淑荷，王愛(ài)軍.HPLC法同時(shí)測(cè)定黃連雙清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（9）：1612－1616.

［5］ 劉峰.HPLC法測(cè)定天麻眩暈寧合劑中天麻素和芍藥苷的含量［J］.藥學(xué)研究，2014，33（7）：386－388.

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Determ ination of paeoniflorin and berberine hydrochloride in Baidai Pills by HPLC

MA Shuai1，GE Jie-ying2，ZHOU Peng1
（1．Zibo Institute for Food and Drug Control，Zibo 255086，China；2．Anqiu Luan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Anqiu 262100，China）

ObjectiveTo establish an HPLCmethod for the determination of paeoniflorin and berberine hydrochloride in Baidai Pills.M ethodsPaeoniflorin and berberine hydrochloride were separated on Wondasil C18Superb（4.6 mm×250 mm，5μm）column.Themobile phasewas acetonitrile and 0.3%phosphoric acid－solution in gradientmode.The flow rate was 1.0 mL·min－1.The detection wavelength for paeoniflorin was set at 230 nm，and 320 nm for berberine hydrochloride.ResultsThe linear range of paeoniflorin and berberine hydrochloride were 0.106 29～2.125 8μg·mL－1（r＝0.999 9）and 0.060 21～1.204 2μg·mL－1（r＝0.999 9），and their average recoverieswere98.45%and 100.52%respectively.ConclusionThemethod can be used for the quality control of Baidai Pills.

Baidai Pills；Paeoniflorin；Berberine Hydrochloride；HPLC

R927．2

A

2095－5375（2015）07－0398－003

馬帥，女，藥師，研究方向：藥物分析，E－mail：331425710＠qq.com