朱偉民，周廣福，唐本森，嚴(yán)賢科，李暻

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論著·臨床

P16蛋白在骨肉瘤新輔助化療效果預(yù)測中的價值

朱偉民，周廣福，唐本森，嚴(yán)賢科，李暻

目的 觀察P16蛋白表達在骨肉瘤(OS)患者新輔助化療效果預(yù)測中的價值。方法 骨肉瘤患者40例，術(shù)前均進行了藥物輔助化療，通過手術(shù)標(biāo)本及組織活檢構(gòu)建石蠟包埋組織芯片40例，采用免疫組化染色法對P16的表達進行分析。當(dāng)>30%的細胞核著色時為P16陽性。對化療后手術(shù)切除的38例標(biāo)本進行分析，≥90%的腫瘤壞死時為良，<90%為差。統(tǒng)計患者性別、年齡、腫瘤部位以及組織病理類型與腫瘤壞死之間的關(guān)系。采用單因素和多因素分析法進行分析。結(jié)果P16總體表達率為62.5%(25/40)，治療后腫瘤中位壞死率為95.0%，57.9%(22/38)的手術(shù)患者化療反應(yīng)為“良”。單因素分析表明：P16陽性表達患者中位壞死率以及化療反應(yīng)評“良”率高于P16陰性患者(P<0.01)。Logistic回歸分析表明：P16是反映骨腫瘤細胞對藥物化療反應(yīng)的獨立預(yù)測因素(OR=43.50，CI2.64～708.90，P=0.01)，與患者的年齡、腫瘤類型、性別、部位無關(guān)。結(jié)論P16的表達同骨肉瘤藥物化療效果顯著相關(guān)，可作為一種分子標(biāo)志物用于對術(shù)前進行化療患者的首選。

骨肉瘤；化療反應(yīng)；P16蛋白

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.012

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)為青少年常見腫瘤，發(fā)病率約為2.4%，其中56%為惡性骨腫瘤。從20世紀(jì)70年代開始，化療藥物開始應(yīng)用于骨肉瘤患者，并且取得了顯著的療效。新輔助化療實質(zhì)上是術(shù)前應(yīng)用化療，在治療微小轉(zhuǎn)移灶的同時，控制腫瘤原發(fā)灶以利于保肢手術(shù)的進行，降低局部復(fù)發(fā)率，并根據(jù)骨肉瘤對化療的反應(yīng)調(diào)整術(shù)后的化療方案[1]。盡管這些化療方案都取得了一定程度的成功，但仍有少數(shù)患者對化療沒有反應(yīng)。因此如何對新輔助化療效果進行預(yù)測，防止延誤病情是目前研究的熱點。

P16是細胞周期中非常重要的調(diào)節(jié)因子, 在多種腫瘤細胞周期增殖和細胞分化調(diào)控中起著十分重要的作用[2]。P16是常見的細胞周期依賴性蛋白激酶4抑制因子，當(dāng)其發(fā)生突變、缺失、啟動子去甲基化時導(dǎo)致失活，往往伴隨較差的預(yù)后[3]。本研究通過觀察P16的表達與骨肉瘤術(shù)前化療療效的關(guān)系，為臨床骨肉瘤患者是否進行術(shù)前化療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年1月—2010年12月貴州省骨科醫(yī)院骨科手術(shù)治療原發(fā)性O(shè)S患者40例，均符合《軟組織與骨腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；患者術(shù)前均進行了新輔助化療。40例中男19例，女21例，年齡9～75歲，中位年齡15歲；病程1～18個月，中位病程4.5個月；無家族遺傳史。腫瘤部位：股骨14例(35.0%)，脛骨11例(27.5%)，肱骨5例(12.5%)，其他部位7例(17.5%)，另3例患者無腫瘤部位記錄(7.5%)。病理類型：成骨細胞型23例(57.5%)，軟骨細胞型5例(12.5%)，成纖維細胞型4例(10.0%)，其他類型3例(7.5%)，5例患者無病理分型(12.5%)。術(shù)前活檢：40例患者均為高分化OS。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 新輔助化療： OS新輔助化療用藥方案主要為大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)、阿霉素(ADM)、順鉑(CDP)和異環(huán)磷酰胺(IFO)等4種藥物。用藥方法：前2周每周給予MTX 8～12 g/m2、CDP 120 mg/m2，連用12次，間隔1周后再予IFO 2 g/m2連用5 d；ADM 30 mg/m2，連用3 d，間隔2周后進行第2次化療，術(shù)前化療3次。在明確診斷后的第11～12周進行手術(shù)。收集相關(guān)資料：性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型、腫瘤壞死率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織軟組織和骨腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤進行病理學(xué)診斷[4]。按照Huvos標(biāo)準(zhǔn)(腫瘤壞死的總表面積占整個骨橫切面的面積百分比)對化療后腫瘤壞死程度進行評估，當(dāng)腫瘤壞死面積≥90%為化療反應(yīng)良，<90%為差[5]。

1.2.2 P16蛋白檢測： 對OS患者40例(2例患者未進行手術(shù)，僅行組織活檢)的腫瘤組織標(biāo)本用福爾馬林固定，石蠟包埋。取每個腫瘤樣本組織中心部位放進石蠟包埋的接受器中，制備組織微陣列(tissue microarray，TMA)。每個患者至少采用直徑為3 mm的中心組織2個用于構(gòu)建微陣列，切片機切成組織薄片，并進行免疫組織化學(xué)(immunohistochemical，IHC)染色。將TMA石蠟切片于60℃處理20 min，采用生物素—親和素辣根過氧化物酶體復(fù)合物法對P16進行染色，試劑為鼠抗P16單克隆抗體(Sigma公司)。以人宮頸黏膜作為陽性對照，人腎組織為陰性對照。TMA切片經(jīng)過3位骨科病理醫(yī)師閱片，對P16表達程度進行評分(對每個患者反復(fù)評分直到得到一致的結(jié)果，細胞漿中染色不計)。P16陽性表達在腫瘤中分布較為均一，陰性表達為細胞核無著色(圖1見封3)。按陽性細胞面積占整張切片面積的比例進行分析，當(dāng)細胞核著色大于30%時為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨立樣本t檢驗；非參數(shù)連續(xù)變量以中位值表示，并用Mann-WhitneyU檢驗。分類變量用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。采用Logistic回歸分析化療反應(yīng)的預(yù)測變量。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色分析及病理性壞死反應(yīng) 化療后對腫瘤壞死程度進行評估，22例(57.9%)患者化療反應(yīng)為良；16例(42.1%)化療反應(yīng)差，另外2例患者因腫瘤擴散無法切除，僅取活檢進行病理檢測。P16在腫瘤組織中陽性表達25例(62.5%)，陰性表達15例(37.5%)。見表1。

P16陽性腫瘤患者的中位壞死率和良化療反應(yīng)率明顯高于P16陰性者(P<0.01)。P16陽性和陰性患者的年齡、組織病理類型、腫瘤部位無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。男性患者中，P16表達率雖高于女性，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(60.0%vs. 40.0%，P>0.05)。見表1。

表1 P16陽性和陰性患者臨床病理特征的比較

2.2 化療反應(yīng)的相關(guān)因素分析P16的表達與新輔助化療為“良”顯著相關(guān)(OR=43.50，95%CI2.64～708.90，P=0.01)，而新輔助化療效果與患者的性別、年齡、組織病理類型、腫瘤部位等因素沒有關(guān)系，因而P16的表達可以作為新輔助化療效果的預(yù)測指標(biāo)。見表2。

表2 臨床病理特征與OS患者接受新輔助化療腫瘤 壞死的Logistic回歸分析

3 討 論

隨著多種新型化療藥物的應(yīng)用以及化療方式的改進，對OS患者的治療已有很大發(fā)展，5年生存率已從15%～20%增加到55%～80%[6，7]，因此新輔助化療已成為很多患者在手術(shù)前的首選治療方式。本研究發(fā)現(xiàn)40例OS患者中，22例患者化療反應(yīng)為良(腫瘤壞死≥90%)；16例患者化療反應(yīng)差(腫瘤壞死<90%)，提示仍有一部分患者對化療無反應(yīng)，因此如何對新輔助化療效果進行事前預(yù)測很有意義。

目前盡管已有多個生物標(biāo)志物可用于預(yù)測OS化療后的生存期，包括P-糖蛋白、Ki-67、HER2等，但這些標(biāo)志物同OS化療效果的關(guān)系不明顯。例如，Roe-sler等[8]報道了92例OS患者手術(shù)和化療的治療效果，發(fā)現(xiàn)腫瘤中P-糖蛋白升高與預(yù)后差不相關(guān)，這其中就包括轉(zhuǎn)移以及肉瘤引起的死亡患者。此外有研究還證明P-糖蛋白與化療后壞死反應(yīng)的降低也無相關(guān)性，而HER2、Ki-67與OS生存期短也無明顯關(guān)系[9]。

細胞周期素和細胞周期素依賴性激酶 (cycline-dependentkinases，CDKs) 是細胞周期進程的核心元件。目前發(fā)現(xiàn)編碼CDKs抑制劑的基因是抑癌基因P16,其為許多化療藥物作用靶點[10]。因此我們推斷P16的表達可能與化療藥物的療效相關(guān)。目前報道推薦以腫瘤壞死反應(yīng)≥90%作為輔助化療的療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，可用于預(yù)測生存[11]。因此我們用IHC法檢測了OS患者癌組織中P16的表達。P16在40例OS患者中陽性表達25例，陰性表達15例。而且，P16陽性腫瘤患者中，中位壞死率和化療良反應(yīng)明顯高于陰性者，15例P16陰性表達的患者化療壞死反應(yīng)率低。通過后期的隨訪，本研究中患者化療反應(yīng)好的往往生存周期比較長?；貧w分析也表明：P16的表達是化療反應(yīng)的獨立預(yù)測因素，同年齡、腫瘤類型、性別、部位無關(guān)(OR=43.50，95%CI2.64～708.90，P=0.01)。結(jié)果說明P16的表達與OS患者腫瘤細胞對化療反應(yīng)敏感程度相關(guān)，這一結(jié)果同Umbreit等[12]研究結(jié)果相同，他們發(fā)現(xiàn)P16的表達同OS患者綜合治療后預(yù)后差相關(guān)。也有研究報道，P16 蛋白的失活可能促進OS的惡性進展過程,P16 蛋白的表達和腫瘤細胞凋亡有關(guān)，可作為判斷骨肉瘤惡性程度和預(yù)測預(yù)后的重要參考指標(biāo)[13]。 本研究37.5%的OS患者P16陰性表達，分析P16表達的差異可能受到患者遺傳差異的影響。研究發(fā)現(xiàn)OS患者中有G1期檢驗點調(diào)控蛋白的異常。例如，有超過60%的OS患者在染色體13q14處有雜合性丟失，7%～23%的OS患者P16基因突變[14]。Jiang等[15]在15例不表達P16的OS患者中能夠檢測到P16的突變，而其中12例該基因啟動子區(qū)部分或全部甲基化。因此仍需要進一步研究分析基因型和表型之間的聯(lián)系以及P16的表達和缺失同臨床預(yù)后的關(guān)系。

本研究觀察到在成骨細胞型患者中，P16的表達較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，還發(fā)現(xiàn)組織病理類型不是化療反應(yīng)的預(yù)測因子，分析其可能原因是本研究的樣本量較小，而P16的表達同化療治療反應(yīng)的聯(lián)系更為緊密一些，但仍需要進一步大數(shù)據(jù)的研究。

總之，我們證明了P16的表達與OS藥物化療反應(yīng)性顯著相關(guān)。P16可以作為一種判斷是否對OS進行化療的標(biāo)志物，在治療前選擇性地對P16陽性的患者進行治療，將有助對于提高藥物治療的療效，而陰性患者可能不適合進行術(shù)前藥物化療。

1BorysD,CanterRJ,HochB,etal.P16expressionpredictsnecroticresponseamongpatientswithosteosarcomareceivingneoadjuvantchemotherapy[J].HumPathol,2012,43(11):1948-1954.

2Al-MohannaMA,ManogaranPS,Al-MukhalafiZ,etal.Thetumorsuppressorp16(INK4a)geneisaregulatorofapoptosisinducedbyultravioletlightandcisplatin[J].Oncogene,2004,23(1):201-212.

3ChristopherDM,FletcherKK,FredrikM.軟組織與骨腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:398.

4 方三高,肖華亮,周曉軍.WHO(2013)骨腫瘤分類的新成員[J].診斷病理學(xué)雜志,2014,21(4):251-255.

5Bar-AdV,WangZX,LeibyB,etal.Combinationofp16levelsandpre-radiotherapyfactorspredictsoutcomeinpatientstreatedfororopharyngealcarcinoma[J].JBUON,2013,18(4):982-988.

6Gonzalez-VasconcellosI,DomkeT,KuosaiteV,etal.DifferentialeffectsofgenesoftheRb1signallingpathwayonosteosarcomaincidenceandlatencyinalpha-particleirradiatedmice[J].RadiatEnvironBiophys,2011,50(1):135-141.

7ShchorsK,PerssonAI,RostkerF,etal.Usingapreclinicalmousemodelofhigh-gradeastrocytomatooptimizep53restorationtherapy[J].ProcNatlAcadSciUSA,2013,110(16):E1480-E1489.

8RoeslerR,SchwartsmannG.Failureofanti-EGFRtherapyinp16-positiveheadandneckcancer[J].LancetOncol,2013,14(11):e436-e437.

9LiaoX,YangS,ShaoZ,etal.Effectofexogenousp16ink4aandhRb1genesoncellcycleregulationofosteosarcomacell[J].JournalofHuazhongUniversityofScienceandTechnology-MedicalSciences,2005,25(6):679-682.

10MohsenyAB,TiekenC,VanDerVeldenPA,etal.SmalldeletionsbutnotmethylationunderlieCDKN2A/p16lossofexpressioninconventionalosteosarcoma[J].GenesChromosomesCancer,2010,49(12):1095-1103.11YiG,HeZ,ZhouX,etal.Lowconcentrationofmetformininducesap53-dependentsenescenceinhepatomacellsviaactivationoftheAMPKpathway[J].IntJOncol,2013,43(5):1503-1510.

12UmbreitC,AderholdC,FaberA,etal.Unexpectedalterationofβ-cateninandc-KITexpressionby5-FUanddocetaxelinp16-positivesquamouscellcarcinomacomparedtoHPV-negativeHNSCCcellsinvitro[J].AnticancerRes,2013,33(6):2457-2465.

13 何武兵,陳麗紅,張旭鳴,等.骨肉瘤中P16蛋白的表達及其與細胞凋亡的關(guān)系[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,44(6):429-432.

14MohsenyAB,SzuhaiK,RomeoS,etal.OsteosarcomaoriginatesfrommesenchymalstemcellsinconsequenceofaneuploidizationandgenomiclossofCdkn2[J].JPathol,2009,219(3):294-305.

15JiangR,GaoZL,SunM,etal.ZincfingerX-chromosomalproteinpromotesgrowthandtumorigenesisinhumanosteosarcomacells[J].PakJMedSci,2013,29(4):997-1002.

Predictive value of P16 protein on adjuvant chemotherapy effect in patients with osteosarcoma

ZHUWeimin,ZHOUGuangfu,TANGBensen,YANXianke,LIJing.

DepartmentofOsteoarthropathy,GuizhouOrthopedicsHospital,Guiyang550007,China

Objective To study the predictive value of P16 protein expression in osteosarcoma(OS) patients under neoadjuvant chemotherapy.Methods 40 patients with OS were selected,all patients received durg adjuvant chemotherapy,paraffin embedded chips were established through the operation specimens and biopsy,immunohistochemistry staining method was used to analyze the expression of P16. P16 was positive when nuclear stained were more than 30%. The resection specimens of 38 patients after chemotherapy were analyzed to determine tumor necrosis percentage, when tumor necrosis was more than 90% it’s good, when tumor necrosis was less than 90%, it’s bad. The relationship between patient gender, age, tumor location, pathological type and tumor necrosis were analyzed using single factor and multiply factor analysis.Results The expression rate of P16 was 62.5%(25/40), after treatment the median tumor necrosis rate was 95.0%,57.9%(22/38) of patients were "good" at response to chemotherapy. Single factor analysis showed that:P16 positive patient’s median necrosis rate and chemotherapy response"good" rate were higher than P16 negative patients(P<0.01).Logisticregressionanalysisshowedthat:P16wasindependentpredictorofchemotherapyresponse(OR=43.50,95%CI2.64-708.90,P<0.01),therewasnocorrelationbetweenP16expressionandgender,age,tumortype,location.Conclusion The expression of P16 was significantly related to chemotherapy effect in osteosarcoma, it could be used as a marker to choice the patients in the need for chemotherapy before operation.

Osteosarcoma；Chemotherapy response;P16 protein

550007 貴陽，貴州省骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)科

2014-09-02)