王艷紅，賈桂燕*，葛文中，王占斌，楊翔宇，張 娣

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.泰來縣第一中學(xué)，黑龍江齊齊哈爾162400）

番茄早疫病是果蔬生產(chǎn)或采后常見病害，也是一種世界性病害，在美國、澳大利亞、以色列、印度、希臘等地發(fā)病率都很高，嚴(yán)重時(shí)可使產(chǎn)量損失35%～78%[1，2]。目前，用于防治這種病原菌的方法幾乎均為化學(xué)方法，帶來了很多食品安全隱患。同時(shí),長期、大量地使用化學(xué)殺菌劑會(huì)造成環(huán)境污染、病菌產(chǎn)生抗藥性等問題，因此，生物防治的研究引起了人們廣泛的關(guān)注[3]。由于中藥材具有副作用小，來源廣，價(jià)格低廉，較少出現(xiàn)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，使得從中草藥中篩選抗菌藥物越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[4]。因此，研究高效低毒的植物源殺菌劑已成為當(dāng)今新型殺菌劑創(chuàng)新研究的熱點(diǎn)之一[5]。為了尋找抑菌效果顯著、來源廣泛的生物類殺菌劑，發(fā)現(xiàn)多種中藥有明顯的抑菌效果[6-8]，選定大黃等15 種平時(shí)較多見的抑菌效果較好的中藥材，測定其乙醇提取物對番茄早疫病的抑菌效果。

大黃（Chinese rhubarb）是蓼科多年生草本植物，藥用其根及根莖，味苦、性寒，功能瀉下攻積、清熱瀉火、止血解毒、活血祛瘀。是一種很好的清熱解毒功效藥，具有抑菌作用[9]。本文測定了其對番茄早疫病的最低抑菌濃度、對菌絲生長、孢子萌發(fā)的影響等，旨在為研制和開發(fā)防治番茄早疫病新型植物源農(nóng)藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

1.1.1 供試中藥材 青蒿、大青葉、龍膽、板藍(lán)根、苦參、地榆、大黃、甘草、黃連、川楝子、苦楝皮、白鮮皮、黑胡椒、細(xì)辛、蒼耳子均購于大慶福瑞邦醫(yī)藥公司。

1.1.2 供試菌種及試劑 番茄早疫病菌（Alternaria solani）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院微生物教研室提供；所用試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

天平（上海精科天平）；水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA24N 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HZQ-R 空氣浴振蕩器（中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥材提取物的制備 將1.1.1 項(xiàng)下各中藥粉碎，過20 目篩，分別稱取50g 至1000mL 圓底燒瓶中，加入95%的乙醇500mL，浸泡8h，80℃水浴加熱，回流提取2h，減壓抽濾，重復(fù)上述提取過程3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至小體積[10]，用50%乙醇定容至200mL，生藥濃度為0.25g·mL-1保存，備用。

各中藥材提取物編號(hào)為：（1）青蒿、（2）大青葉、（3）龍膽、（4）50%乙醇、（5）板藍(lán)根、（6）苦參、（7）地榆、（8）大黃、（9）甘草、（10）黃連、（11）川楝子、（12）苦楝皮、（13）白鮮皮、（14）黑胡椒、（15）細(xì)辛、（16）蒼耳子。（4）為對照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 馬鈴薯培養(yǎng)基的制備 按著參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）的制備。

1.2.3 番茄早疫病孢子懸液的制備 按參考文獻(xiàn)[13]的方法，將1.1.2 項(xiàng)的供試菌種在無菌條件下接入PDA 培養(yǎng)基中，恒溫25℃培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)幾代后，在試驗(yàn)前3～5d 再接種1 次培養(yǎng)備用。

上述菌種在PDA 平板上培養(yǎng)7d 后，注入4℃無菌水，用滅菌毛刷輕輕刮除氣生菌絲，20～22℃培養(yǎng)箱中干燥，6h 后即可形成大量的分生孢子，用無菌水洗下孢子，制備成孢子懸液（1×106～107個(gè)·mL-1），備用。

1.2.4 供試15 種中藥材抑菌率的測定 將100mL固體PDA 培養(yǎng)基用微波爐融化后，冷卻至40℃左右，無菌操作條件下將待測菌株孢子懸液5mL 加入培養(yǎng)基中，振蕩混勻后倒入15cm×20cm 的平板內(nèi)，厚度約3.50mm，培養(yǎng)基凝固后均勻擺放牛津杯，每杯加入中藥材提取液200uL，做好藥物標(biāo)記，每種藥液設(shè)3 個(gè)平板。將平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察并用十字交叉法測定抑菌圈直徑[12]，按下列公式計(jì)算抑菌率[13]。

1.2.5 大黃最低抑菌濃度的測定 將大黃母液（生藥濃度為0.25g·mL-1）稀釋，分別稀釋為母液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64（0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125g·mL-1、0.00390625）將大黃母液編為1 號(hào)，其他稀釋液按順序編至2～7 號(hào)，以50%的乙醇為對照，并記為8 號(hào)。按2.4 中方法將8 個(gè)牛津杯均勻擺放在固體培養(yǎng)基中，每杯加入1～8 號(hào)液體200μL，做好標(biāo)記，以下步驟同1.2.4。

1.2.6 大黃藥液抑制菌絲生長的測定 無菌操作下將4mL 大黃母液加入100mL 液體PDA 中，冷卻至40℃左右時(shí)分別接入1mL 2.3 項(xiàng)下制備的孢子懸液，50%乙醇為對照，放入空氣浴振蕩器中，25℃震蕩培養(yǎng)，2d 后取出一瓶，之后每隔1d 取出一瓶，并做好標(biāo)記1～5 號(hào)，減壓抽濾，所得菌絲放入50℃烘箱中烘干至恒重，稱量。以上操作過程重復(fù)3 次。

1.2.7 大黃藥液抑制孢子萌發(fā)的測定 把按1.2.3項(xiàng)下操作所得的番茄早疫孢子懸液配制成l00 倍顯微鏡下每視野30～40 個(gè)孢子的濃度，將大黃母液稀釋至原藥液濃度的1/16 與上述孢子懸浮液以1∶l 配比混合，分別吸取100μL 置于脫脂棉保濕的培養(yǎng)皿中的凹玻片上，50%乙醇為對照處理組，28℃暗箱培養(yǎng)。4h 后鏡檢各處理的孢子萌發(fā)情況[14]，以后每小時(shí)鏡檢一次，至對照完全萌發(fā)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 供試中藥材對番茄早疫病的抑菌率

供試的15 種中藥材的95%乙醇提取物對番茄早疫病菌均有不同程度的抑制作用，其中黃連和大黃的抑菌效果最好，大黃的抑菌率高達(dá)93.9%，除龍膽外，其他14 種中藥材的乙醇提取物的抑制率也均達(dá)到80%以上（見表1），因此選大黃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 15 種中藥材對番茄早疫病菌的抑菌率Tab.1 Inhibition rate of 15 kinds of Chinese herbal medicines on Alternaria solani

2.2 大黃拮抗番茄早疫病的最低抑菌濃度

不同濃度大黃藥液對番茄早疫病菌的抑制率，具體結(jié)果見表2。

表2 不同濃度的大黃對番茄早疫病的抑菌率Tab.2 Inhibition rate of different concentrations of rhubarb on Alternaria solani

由表2 可知，大黃藥液隨濃度降低，其抑制番茄早疫病的抑菌率降低，最低抑菌濃度為0.015625g·mL-1，當(dāng)把大黃稀釋到0.0078125g·mL-1時(shí)，大黃幾乎不具有抑菌能力。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間大黃對番茄早疫病菌絲干重的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間大黃處理組（藥液母液濃度為0.25g·mL-1）及對照組的番茄早疫病菌的菌絲干重，結(jié)果如圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間大黃母液及對照處理的菌絲干重Fig.1 Rheum and control treatment on mycelium dry weight at different time

由圖1 可見，大黃對菌絲的生長有很強(qiáng)的抑制作用，50%乙醇對照處理組，菌絲生長的最旺盛期在第4d，大黃母液處理組，菌絲生長的最旺盛期在第5d，延遲了番茄早疫菌生長旺盛期的到來。

2.4 大黃藥液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

大黃藥液處理4h 后，番茄早疫病菌孢子基本無變化，少數(shù)孢子產(chǎn)生不明顯的芽管，孢子與芽管交接處呈不正常腫大，對照組萌發(fā)率為50%。延長培養(yǎng)時(shí)間，處理12h 后觀察，對照處理組孢子萌發(fā)達(dá)95%以上，菌絲長度達(dá)孢子長度10 倍以上，大黃藥液處理的孢子萌發(fā)率僅為4.75%，且與對照組比（如圖2 中B），大黃藥液處理的孢子畸形，多為成串或成堆的囊泡，少數(shù)產(chǎn)生芽管，但較短，一般為孢子長度的二分之一，極少數(shù)芽管與孢子等長（如圖2中A）。

圖2 大黃藥液處理12h 后番茄早疫病菌孢子萌發(fā)形態(tài)Fig.2 Spore germination morphology of Alternaria solani by rheum treatment after 12 hours

3 結(jié)論

本論文所考察的15 種中藥材乙醇提取物對番茄早疫病均有一定的抑制作用，其中中藥黃連作用最強(qiáng)，大黃次之，大黃的抑制率達(dá)93.9%，且除龍膽外其他14 種中藥材的乙醇提取物的抑制率均達(dá)到80%以上。雖然數(shù)據(jù)顯示黃連的抑菌作用最強(qiáng)，但本文對大黃進(jìn)行了深入實(shí)驗(yàn)，主要因?yàn)榇簏S的抑制作用較為穩(wěn)定。參照文獻(xiàn)可以得出，黃連在48h 后抑菌圈的直徑會(huì)逐漸變小，但大黃的抑菌圈直徑會(huì)基本保持不變。不同培養(yǎng)時(shí)間的大黃乙醇提取液對番茄早疫病菌菌絲也有不同的抑制作用，大黃可以延遲菌絲的生長旺期，同時(shí)大黃的乙醇提取液對孢子萌發(fā)也具有較強(qiáng)的抑制作用。

中藥材有上千種，本實(shí)驗(yàn)只選取了其中的15種進(jìn)行研究，主要因?yàn)檫@15 種藥材價(jià)格低廉，容易獲得，而且它們的抑菌作用也較強(qiáng)。中藥材活性成分復(fù)雜，提取方法和所用溶劑不同，提取物中化學(xué)成分亦不同，本實(shí)驗(yàn)中的試劑也只采用了95%的乙醇作提取溶劑，沒有進(jìn)行甲醇、丙酮等溶劑的提取，因而提取物的活性成分不一定有代表性，尚有許多基礎(chǔ)研究有待開展。現(xiàn)如今，中藥抑菌作用的研究方法和手段也在不斷改善和提高，但目前對中藥抗菌作用的研究多局限于體外，體內(nèi)的研究較少?！把逅幚韺W(xué)”的提出,將使中藥抗菌作用的研究進(jìn)一步深入到體內(nèi)，從而推動(dòng)抗菌中藥的研究和開發(fā)[15]。

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