黃東璋　劉明生　王健　甘輝群　譚菊

摘要：為研究硒中毒對雛鵝免疫機能的影響，在基礎日糧中按2.0、5.0 mg/kg添加亞硒酸鈉（試驗組），以飼喂基礎日糧為對照組，并于試驗開始后7、14、21、28、35、42 d每組隨機抽取6羽鵝，分別空腹稱體質(zhì)量后自心臟采血 5 mL，用于T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率測定和血清中與自由基有關酶的測定，之后捕殺，摘取胸腺、脾臟、法氏囊，用于計算免疫器官指數(shù)。結(jié)果表明，硒中毒時雛鵝血清中GSH-PX、SOD、CAT活性，GSH含量與對照組相比顯著或極顯著減少（P<0.05 或P<0.01），而MDA的含量則顯著或極顯著增加（P<0.05或P<0.01），同時，試驗組雛鵝的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率顯著下降（P<0.05），免疫器官指數(shù)顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。這表明硒中毒時雛鵝的免疫機能低下，抗病力降低，自由基產(chǎn)生增多，與自由基清除有關的酶活性降低，過氧化物產(chǎn)生增多，最后導致機體生長發(fā)育遲緩，甚至死亡。

關鍵詞：雛鵝；硒中毒；血清酶；淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；免疫器官指數(shù)

中圖分類號： S852.4+3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0218-03

收稿日期：2014-04-08

作者簡介：黃東璋（1981—），男，江蘇射陽人，碩士，講師，主要從事畜禽疫病防控研究。Tel：（0523）86158007；E-mail：112571065@qq.com。 硒是動物必需的一種微量營養(yǎng)元素，參與許多重要的生物進程。硒具有很強的抗氧化能力，并且與維生素 E 具有協(xié)同作用，保護細胞及線粒體膜免受氧自由基的損害[1]。現(xiàn)在一般認為，硒可能是作為免疫系統(tǒng)的非特異性刺激因子，參與調(diào)節(jié)免疫功能狀態(tài)，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但生產(chǎn)實踐中，在防治動物硒缺乏病時，由于補硒方法不當，如一次補硒過多，補硒時間過長，或硒與飼料混合不均勻等而發(fā)生硒中毒的事例也時有發(fā)生[2]。目前國內(nèi)外對畜禽硒中毒的研究報道較多，但主要集中豬、雞等動物的病理學和血清酶等方面[3-6]，而硒中毒對鵝免疫機能的影響還未見報道。本試驗以健康蘇牧1號白鵝為試驗動物，研究硒中毒時對雛鵝免疫機能的影響，為臨床防治鵝硒中毒提供試驗依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器

XSP-4C 雙目生物顯微鏡（上海炳宇光學儀器有限公司生產(chǎn)），紫外分光光度計（751GD，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)），低溫超速離心機（TGL-16B，揚州科能電力電子設備有限公司生產(chǎn)），漩渦混勻攪拌器（XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn)），電熱恒溫水浴箱（TZL-5005，蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司生產(chǎn)），精密天平（UX220H，日本島津有限公司生產(chǎn)）。

1.2主要藥品與試劑

亞硒酸鈉（Na2SeO3·5H2O），分析純，含量（以干基計）98.7%，含硒（以干基計）45.5%，由江蘇倍康藥業(yè)有限公司提供；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；PHA（植物血凝素），購自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清，購自上海拜力生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)液，購自美國CORNING公司。

1.3試驗動物

1日齡蘇牧1號健康雛鵝180羽，由江蘇畜牧科技示范園提供。

1.4日糧的配制及日糧硒水平

試驗采用玉米-餅粕型基礎日糧，其營養(yǎng)組成除了硒之外，均參照蘇牧1號白鵝營養(yǎng)需要進行配比（表1），同時根據(jù)GB/T 13883—2008硒測定法測定基礎日糧中硒的含量。

1.5試驗方法

1.5.1飼養(yǎng)方法與分組將1日齡試驗鵝預飼1周，然后將180羽健康無疾病試驗鵝隨機分為3組，每組60羽。其中Ⅰ組為對照組，喂基礎日糧；Ⅱ組、Ⅲ組為試驗組，在基礎日糧中分別添加亞硒酸鈉2.0、5.0 mg/kg。鵝自由采食和飲水，用藥和防疫按鵝場常規(guī)程序進行，連續(xù)飼喂，試驗期42 d。

1.5.2樣品的采集與處理分別于試驗開始后7、14、21、28、35、42 d每組隨機抽取6羽鵝，分別空腹稱質(zhì)量后自心臟采血5 mL，采血時間統(tǒng)一于08：00—09：00進行。所采血樣分為2份，1份用EDTA-Na2抗凝，用于T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率測定；另1份不加抗凝劑，常規(guī)分離血清，置于4 ℃冰箱，用于血清中與自由基有關酶（GSH-PX、SOD、CAT、）活力及GSH含量、MDA含量的測定。之后捕殺，摘取胸腺、脾臟、法氏囊，用于計算免疫器官指數(shù)。

1.5.3主要檢測指標及檢測方法

1.5.3.1血清酶測定按試劑盒說明書方法進行，用紫外分光光度計進行測定。

1.5.3.2T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率測定RPMI 1640培養(yǎng)液，用前調(diào)至含胎牛血清10%、青霉素100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL，用NaHCO3調(diào)pH值至7.2～7.4；PHA用RPMI 1640基礎培養(yǎng)液配成1 mg/mL。取無菌肝素抗凝血0.1 mL，加入1.8 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中，同時加入PHA 0.1 mL，將細胞置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天搖動1次。2 500 r/min 離心10 min，棄上清液，留0.2 mL沉淀細胞制片，迅速吹干。姬姆薩染色10～20 min，水洗，干燥，油鏡觀察。順序計數(shù)200個淋巴細胞，分別記錄轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)，并計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：淋巴細胞轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)/200個淋巴細胞×100%。

1.5.3.3免疫器官指數(shù)測定各組鵝分別于7、14、21、28、35、42 d撲殺，摘取法氏囊、脾臟、胸腺，并稱其質(zhì)量。免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮質(zhì)量（g）/鵝宰前空腹質(zhì)量。endprint

1.6數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1硒中毒對雛鵝血清酶的影響

由表2可知，試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）GSH-PX活性與對照組（Ⅰ組）相比均減少，且于試驗21 d時呈顯著差異（P<0.05），28、35、42 d時呈極顯著差異（P<0.01），而試驗組Ⅱ組和Ⅲ組之間，除42 d時差異顯著外，其余均不顯著（P>005）；試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）SOD活性與對照組相比均減少，且于試驗21、28 d時呈顯著差異（P<0.05），35、42 d時呈極顯著差異（P<0.01），試驗組Ⅱ組和Ⅲ組之間，35、42 d時差異極顯著，其余均不顯著（P>0.05）；試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）GSH值與對照組相比均減少，且于試驗21 d時呈顯著差異（P<005），28、 35、42 d時呈極顯著差異（P<0.01），而試驗組Ⅱ組和Ⅲ組之間，42 d時差異極顯著，其余均不顯著（P>005）；試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）CAT值與對照組相比均減少，且于試驗28 d時呈顯著差異（P<0.05），35、42 d時呈極顯著差異（P<0.01），而試驗組Ⅱ組和Ⅲ組之間，差異均不顯著（P>005）；試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）MDA含量與對照組相比均增加，且于試驗7、14 d時呈顯著差異（P<0.05），21、28、35、42 d時呈極顯著差異（P<0.01），而試驗組Ⅱ組和Ⅲ組之間，差異均不顯著（P>0.05）。

2.2硒中毒對雛鵝T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響

試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）各日齡雛鵝淋巴細胞轉(zhuǎn)化率與對照組相比，均呈下降趨勢。其中，14 d時，試驗組（Ⅱ和Ⅲ組）雛鵝淋巴細胞轉(zhuǎn)化率與對照組相比差異均顯著（P<0.05）；21、28、35、42 d時日齡時，試驗組與對照組相比，差異均極顯著（P<0.01），而試驗組Ⅱ組與Ⅲ組之間，除28 d時差異顯著外，其余均不顯著（P>0.05）（表3）。

2.3硒中毒對雛鵝免疫器官指數(shù)的影響

從表4可以看出，試驗組（Ⅱ組、Ⅲ組）雛鵝法氏囊、脾臟和胸腺的器官指數(shù)較對照組均有不同程度的下降。其中，法氏囊器官指數(shù)，21 d和42 d時，2個試驗組與對照組相比，差異均顯著（P<0.05），28 d和35 d時，試驗組與對照組相比，差異均極顯著（P<0.01），而試驗Ⅱ組與Ⅲ組之間，28 d時差異極顯著（P<0.01），42 d時差異顯著（P<0.05），其余均不顯著（P>0.05）；脾臟器官指數(shù)，21 d時，2個試驗組與對照組相比均呈顯著差異（P<0.05），28、35、42 d時，試驗組與對照組相比，差異極顯著（P<0.01），而試驗Ⅱ組與Ⅲ組之間，除42 d時，差異顯著（P<0.05）外 其余均不顯著；胸腺器官指數(shù)，14、21、28 d時，2個試驗組與對照組相比，差異均顯著（P<0.05），35 d和42 d時，試驗組與對照組相比 差異均極表3硒中毒對雛鵝T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響顯著（P<0.01），而試驗Ⅱ組與Ⅲ組之間，28、35 d時差異顯著（P<0.01），其余均不顯著（P>005）。

3討論

3.1硒中毒對雛鵝血清與自由基有關酶的影響

自由基是機體進行生命活動時所產(chǎn)生的一種活性分子。當機體處于疾病狀態(tài)時，都會引起自由基產(chǎn)生過量，而體內(nèi)過多的自由基可引起蛋白質(zhì)、核酸（DNA）變性，導致細胞和組織器官損傷，誘發(fā)各種疾病。

SOD是廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的一種金屬酶，對機體的氧化與抗氧化起重要作用，能催化超氧陰離子 （ O-2· ）產(chǎn)生歧化反應，清除超氧陰離子 （ O-2· ）保護細胞免受損傷，SOD活力的測定可間接反應機體清除自由基的能力。GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，是H2O2和ROOH的主要清除劑。它能特異地催化還原型谷胱甘肽 （GSH）對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結(jié)構和功能完整的作用。CAT是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，是由生物體內(nèi)自由基攻擊生物膜產(chǎn)生的不飽和脂肪酸（PUFA）引起脂質(zhì)過氧化作用而形成的，這種產(chǎn)物還可通過生物體內(nèi)有機物反應的鏈式或鏈式支鏈放大活性氧的破壞作用，引起細胞代謝與功能障礙，甚至死亡。因此，測定機體中的MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細胞受損傷的程度[7]。本研究中硒中毒試驗組雛鵝的GSH-PX、SOD、CAT等與自由基清除有關的酶的含量或活力與對照組相比均減少或降低，而MDA含量則增多，這與賀建忠等[3]報道的豬硒中毒時體內(nèi)自由基的變化和劉明生等[7]報道的肉雞硒中毒時體內(nèi)自由基的變化結(jié)果一致。

4.2硒中毒對雛鵝T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響

T淋巴細胞表面有多種受體，在體外培養(yǎng)中加入特異性抗原或非特異性促有絲分裂原的刺激下，細胞代謝和形態(tài)可發(fā)生一系列變化，如能轉(zhuǎn)化成體積較大的原淋巴細胞。轉(zhuǎn)化細胞數(shù)量可反映機體細胞免疫功能，測定T淋巴細胞的應答能力，診斷細胞免疫缺陷性疾病。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低常作為衡量機體免疫水平的指標。本試驗硒中毒試驗組中雛鵝的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率均降低，影響了機體的免疫功能。

4.3硒中毒對雛鵝免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官是動物執(zhí)行免疫功能的組織機構，它們的發(fā)育狀況直接影響到機體免疫力的高低。臟器指數(shù)又稱臟體比，是動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比值。正常時各臟器與體質(zhì)量的比值比較恒定。臟器指數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器指數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。因此免疫器官臟器系數(shù)可作為評價禽類免疫狀況的良好指標。本試驗結(jié)果顯示，硒中毒時，各免疫器官的臟器指數(shù)隨試驗期的延長明顯減小，且與對照組相比，差異顯著或極顯著。關于硒中毒時免疫器官的組織及形態(tài)學的變化將有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]劉宗平. 現(xiàn)代動物營養(yǎng)代謝病學[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2003.

[2]甘輝群，劉明生，吳敏秋，等. 雛雞硒中毒的診治[J]. 中國家禽，2008，30（4）：42.

[3]賀建忠，郭定宗，楊世錦，等. 硒中毒對豬血清自由基的影響[J]. 中國獸醫(yī)學報，2009，29（12）：1629-1631.

[4]任玉紅，唐朝忠. 雛雞實驗性硒中毒的病理組織學研究[J]. 中國家禽，2006，28（1）：19.

[5]劉田生，霍欣，劉鑫. 雛雞實驗性硒中毒臨床及病理觀察[J]. 中國家禽，2006，28（1）：19.

[6]張守發(fā)，何希君，黃在植，等. 雉雞硒中毒的臨床及病理形態(tài)學觀察[J]. 中國獸醫(yī)科技，1997，27（1）：27-28.

[7]劉明生，甘輝群，譚菊，等. 不同硒源對肉雞血清中與自由基有關酶活力的影響研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007（4）：50-51.呂峰，周爽. 低鹽脅迫下條斑紫菜不同品系體細胞與殼孢子的耐受性差異[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：221-224，229.endprint