朱鴻武，江 丹，謝子英，麥橋勛，雷昌賢，周梅花，孫大勇，趙亞剛

（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州510010）

食管癌是最為常見(jiàn)的腫瘤之一，在世界腫瘤疾病導(dǎo)致的死亡原因中位居第六[1]。中國(guó)是食管癌病死率最高的國(guó)家之一，食管癌在中國(guó)癌癥所致的死亡原因中位居第四[2]。廣東省食管癌病死率位于全國(guó)前列，食管癌為腫瘤死亡原因中排名第二，其中，汕頭地區(qū)的揭陽(yáng)市、南澳縣為食管癌高發(fā)及第一致死腫瘤原因的地區(qū)，食管癌病死率遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)平均水平[2-4]。食管癌主要包括食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EA）。在高風(fēng)險(xiǎn)的國(guó)家和地區(qū)，例如中國(guó)和伊朗，食管癌病例中90%均為ESCC[5]。ESCC發(fā)生局部或遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良最為常見(jiàn)的原因之一，其發(fā)生的分子機(jī)制目前仍未完全闡明。尋找和研究與ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，探索其具體分子機(jī)制，對(duì)于深入理解ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展，及臨床發(fā)現(xiàn)早期診斷的分子標(biāo)志和制訂有效的臨床干預(yù)措施都具有十分重要的意義。

STMN1是一種能夠在細(xì)胞的有絲分裂期和分裂間期改變微管的動(dòng)力學(xué)的微管脫穩(wěn)定化磷蛋白[6]，在多種癌組織中表達(dá)增加，參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、微管動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)和周期調(diào)節(jié)等功能[6]。近年，有報(bào)道STMN1在部分惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[7-12]，提示STMN1是一個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。然而，STMN1在ESCC中的表達(dá)情況和預(yù)后意義尚無(wú)報(bào)道，其與ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系目前尚未闡明。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)150例ESCC組織中STMN1的表達(dá)水平，分析其與ESCC患者臨床特征的關(guān)系，并且在ESCC TE-1細(xì)胞中使用siRNA沉默STMN1的表達(dá)，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Millicell小室侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)初步探索了STMN1對(duì)ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本來(lái)源 ESCC組織芯片購(gòu)于上海芯超生物科技有限公司。所有病例均經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)。

1.1.2 臨床病例資料 所有ESCC患者術(shù)前均未接受化療、放療及其他治療。其中，男113例，女37例；年齡42～84歲，平均（60.14±8.79）歲；腫瘤分化程度：高分化73例，中分化54例，低分化或未分化23例；150例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者72例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者78例；TNM分期（按2009年UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)）：Ⅰ期40例，Ⅱ期67例，Ⅲ期43例。將150例患者分別按年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。

1.1.3 細(xì)胞系與主要實(shí)驗(yàn)材料 人ESCC TE-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；Trizol，LipofectamineTM2000和Opti-MEM?I購(gòu)自美國(guó)Invertrogen公司；RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF、麗春紅染色液和蘇木素染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Millicell小室、NC膜和ECL購(gòu)自Millipore公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；3，5-diaminobenzidine（DAB）、SP法抗兔二抗試劑盒（SP-9001）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司；STMN1siRNA和scramble siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。anti-STMN1一抗（＃3352）購(gòu)自Cell Signaling公司；anti-β-actin一抗（sc-47778）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) TE-1細(xì)胞所用培養(yǎng)液為添加有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，除用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前1周開(kāi)始不使用抗菌藥物以外，所有培養(yǎng)液中已加入青霉素／鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 相關(guān)引物序列和qPCR 使用pubmed BLAST工具和查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，STMN1：正向5′-TAC ACT GCC TGT CGC TTG TC-3′，反向5′-GGG GAA AGG GGG AAT TCT GG-3′；GAPDH[13]：正向5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′，反向5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′。采用Trizol氯仿法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。

1.2.3 相關(guān)siRNA序列及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[14]合成特異性STMN1siRNA（siSTMN1）：正向5′-GAA ACG AGA GCA CGA GAA A-3′，反向5′-UUU CUC GUG CUC UCG UUU C-3′；非特異性siRNA（SCR）：正向5′-GCA AAA GAG CGA AAA G-3′，反向5′-CUU UUC GCU CUU UUG C-3′。按LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟，轉(zhuǎn)染6h以后更換培養(yǎng)液，72h以后收取細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 胰酶消化并收集細(xì)胞，裂解液裂解并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行裁剪，用含5%脫脂牛奶的PBST封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜；洗膜，二抗室溫孵育1h；洗膜后加ECL溶液顯影觀察。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集細(xì)胞，按2.5×106／孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液1mL，待細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)匯合至單層細(xì)胞。采用200μL槍頭劃線，以PBS沖洗掉脫落的細(xì)胞，加入1mL無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于0、24h在顯微鏡下拍照。比較不同組別劃痕邊緣細(xì)胞的遷移距離差別。

1.2.6 Millicell侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) （1）基質(zhì)膠鋪板：用Matrigel 1∶8稀釋，包被Millicell小室底部膜的上室面，置37℃30 min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化（轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)無(wú)需此步驟）。（2）消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，用適量無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。（3）取細(xì)胞懸液100μL（侵襲實(shí)驗(yàn)：5×104個(gè)細(xì)胞；遷移實(shí)驗(yàn)：2.5×104個(gè)細(xì)胞）加入Millicell小室上層，小室下層加入500μL含20%FBS的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48h。（4）結(jié)果統(tǒng)計(jì)：取出Millicell小室，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，甲醇固定30min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS液洗3遍。200倍顯微鏡下選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色 （1）將組織芯片常規(guī)脫蠟至水化。（2）放入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中高壓修復(fù)2min。自然冷卻，PBS液洗2min×3次。（3）以3%的H2O2室溫孵育15min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS液洗2min×3次。（4）滴山羊血清（A液）封閉15min，傾去，滴加STMN1抗體（1∶75稀釋）于切片上，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS液洗3min×3次。（5）滴加生物素化兔二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育30min，PBS液洗3min×3次。（6）滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，濕盒內(nèi)37℃孵育15min，PBS液洗3min×3次。（7）將DAB底物工作液滴加于切片上，顯微鏡下控制顯色，隨后以自來(lái)水終止顯色。（8）蘇木素復(fù)染。（9）常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：STMN1蛋白陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下選取5個(gè)視野（每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)），按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。（1）按細(xì)胞著色深淺評(píng)分：細(xì)胞無(wú)顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。（2）按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比評(píng)分，小于30%為1分，30%～70%為2分，大于70%為3分。取（1）、（2）兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（＋），4～6分為陽(yáng)性（＋＋），≥7分為陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)；多樣本率的比較采用行列表資料的χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析；總體生存率評(píng)估采用Kaplan-Meier法，組間差異采取log-rank檢驗(yàn)，Cox多元回歸分析用以確定獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；組間參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STMN1在ESCC和癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果提示，ESCC組織中STMN1的表達(dá)陽(yáng)性率為67.3%，顯著高于癌旁正常組織中的表達(dá)水平（31.3%），見(jiàn)表1。ESCC中STMN1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度亦普遍高于癌旁正常組織，見(jiàn)圖1。

表1 STMN1在ESCC和癌旁正常組織中的表達(dá)水平比較（n）

2.2 STMN1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系 在與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析中，STMN1蛋白表達(dá)陽(yáng)性者，其TNM分級(jí)明顯高于表達(dá)陰性者（P＜0.01），其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率亦明顯高于STMN1表達(dá)陰性者（P＜0.01）。然而，STMN1蛋白在ESCC中的表達(dá)與年齡、腫瘤部位、性別和腫瘤分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表2。

圖1 STMN1在ESCC和癌旁正常組織中的表達(dá)（×200）

表2 STMN1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 STMN1表達(dá)與ESCC患者生存期的關(guān)系 通過(guò)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存期分析發(fā)現(xiàn)，STMN1表達(dá)陽(yáng)性ESCC患者的生存期明顯短于表達(dá)陰性的患者（P＜0.01，圖2）。單變量和多變量回歸分析提示STMN1表達(dá)陽(yáng)性是ESCC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（表3）。

2.4 轉(zhuǎn)染STMN1siRNA對(duì)TE-1細(xì)胞STMN1表達(dá)水平的變化 qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染STMN1 siRNA（siSTMN1）72h以后，ESCC TE-1細(xì)胞中的STMN1的mRNA表達(dá)水平（圖3A）和蛋白水平（圖3B）均明顯下降，提示干擾效果良好。

圖2 STMN1表達(dá)與ESCC患者生存期的關(guān)系

表3 150例ESCC患者總體生存期的單變量和多變量回歸分析

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA前、后ESCC TE-1細(xì)胞中STMN1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化

2.5 轉(zhuǎn)染STMN1siRNA前、后TE-1細(xì)胞劃痕修復(fù)能力的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用特異性siRNA沉默STMN1的表達(dá)后，ESCC TE-1細(xì)胞相對(duì)于SCR轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞劃痕修復(fù)能力明顯減弱（圖4），提示細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力減弱。

2.6 轉(zhuǎn)染STMN1siRNA對(duì)TE-1細(xì)胞Millicell侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響 Millicell侵襲和轉(zhuǎn)移檢測(cè)結(jié)果顯示，采用特異性siRNA沉默STMN1的表達(dá)后，ESCC TE-1細(xì)胞較SCR轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均明顯減弱（圖5）。

圖4 沉默STMN1后TE-1細(xì)胞劃痕修復(fù)能力減弱

圖5 沉默STMN1后ESCC TE-1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱（×200）

3 討論

STMN1也被稱作stathmin 1、腫瘤蛋白18、metablasin、p18或p19，它由位于人染色體1p36.1的STMN1基因編碼，它是一種能夠在細(xì)胞的有絲分裂期和分裂間期改變微管的動(dòng)力學(xué)的微管脫穩(wěn)定化磷蛋白[6]。由于STMN1參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能，提示其很可能在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著一定的作用。近年來(lái)，已有研究報(bào)道STMN1在膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、鼻咽癌和肉瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用[7-12]。但是，STMN1在ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。

本研究在臨床ESCC腫瘤患者的組織標(biāo)本中通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了STMN1的表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，STMN1在大多數(shù)ESCC組織中呈高水平表達(dá)，STMN1表達(dá)陽(yáng)性的ESCC患者TNM分期顯著高于表達(dá)陰性的患者，而且，STMN1表達(dá)陽(yáng)性的ESCC患者較表達(dá)陰性的患者伴有更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果提示STMN1表達(dá)陽(yáng)性的患者更難于獲得臨床治愈的機(jī)會(huì)。進(jìn)一步生存分析結(jié)果提示，STMN1表達(dá)陽(yáng)性的患者較表達(dá)陰性的患者總體生存期顯著縮短，證實(shí)了STMN1與ESCC患者的預(yù)后不良存在著明顯的相關(guān)性。單變量和多變量回歸分析進(jìn)一步確認(rèn)了STMN1在ESCC患者的預(yù)后中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。

通過(guò)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者初步推測(cè)STMN1的表達(dá)陽(yáng)性提示ESCC患者預(yù)后不良，其原因之一很可能與STMN1促進(jìn)了ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將STMN1siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入ESCC TE-1細(xì)胞中，qPCR和Western blot提示基因干擾效果確切，轉(zhuǎn)染后STMN1無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平均有明顯下降。在劃痕實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉默STMN1的表達(dá)后ESCC TE-1細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力明顯減弱，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力減弱。為了印證這一結(jié)論，作者進(jìn)一步進(jìn)行了STMN1沉默后Millicell侵襲和轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默STMN1的表達(dá)確實(shí)也可以明顯減弱ESCC TE-1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。至此，本研究結(jié)果初步證明了STMN1在促進(jìn)ESCC侵襲和轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

然而，國(guó)外學(xué)者Williams等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中STMN1可以通過(guò)抑制EMT的發(fā)生而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移，提示在腫瘤細(xì)胞中STMN1可能還發(fā)揮著抑瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用。這一特殊現(xiàn)象的原因很可能與其研究所采用的腫瘤細(xì)胞的基因背景不盡相同有關(guān)，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明。

[1] Schweigert M，Dubecz A，Stein HJ.Oesophageal cancer--an overview[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2013，10（4）：230-244.

[2] 鐘釧，譚家駒，徐致祥.食管癌流行病學(xué)病因?qū)W研究進(jìn)展[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，22（1）：1-10，17.

[3] 陳偉三，蔡樹(shù)深，邱杰文，等.廣東省揭陽(yáng)市食管癌流行病學(xué)調(diào)查[J].癌癥，1994，13（2）：159-161，168.

[4] 陳偉三，蔡樹(shù)深，邱杰文，等.南澳縣1987～1992年食管癌發(fā)病動(dòng)態(tài)[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，8（1）：82-86.

[5] Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[6] Rubin CI，Atweh GF.The role of stathmin in the regulation of the cell cycle[J].J Cell Biochem，2004，93（2）：242-250.

[7] Belletti B，Nicoloso MS，Schiappacassi M，et al.Stathmin activity influences sarcoma cell shape，motility，and metastatic potential[J].Mol Biol Cell，2008，19（5）：2003-2013.

[8] Kang W，Tong JH，Chan AW，et al.Stathmin1plays oncogenic role and is a target of microrna-223in gastric cancer[J].PLoS One，2012，7（3）：e33919.

[9] Li N，Jiang P，Du W，et al.Siva1suppresses epithelialmesenchymal transition and metastasis of tumor cells by inhibiting stathmin and stabilizing microtubules[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（31）：12851-12856.

[10] Hemdan T，Lindén M，B Lind S，et al.The prognostic value and therapeutic target role of stathmin-1in urinary bladder cancer[J].Br J Cancer，2014，111（6）：1180-1187.

[11] Wu W，Tan XF，Tan HT，et al.Unbiased proteomic and transcript analyses reveal that stathmin-1silencing inhibits colorectal cancer metastasis and sensitizes to 5-fluorouracil treatment[J].Mol Cancer Res，2014，12（12）：1717-1728.

[12] Hsu HP，Li CF，Lee SW，et al.Overexpression of stathmin 1confers an independent prognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma[J].Tumour Biol，2014，35（3）：2619-2629.

[13] Ford J，Jiang M，Milner J.Cancer-specific functions of sirt1enable human epithelial cancer cell growth and survival[J].Cancer Res，2005，65（22）：10457-10463.

[14] Wang R，Dong K，Lin F，et al.Inhibiting proliferation and enhancing chemosensitivity to taxanes in osteosarcoma cells by RNA interference-mediated downregulation of stathmin expression[J].Mol Med，2007，13（11-12）：567-575.

[15] Williams K，Ghosh R，Giridhar PV，et al.Inhibition of stathmin1accelerates the metastatic process[J].Cancer Res，2012，72（20）：5407-5417.