張學(xué)明　丁海麥　席海燕　李斌　張晶晶　虞飛

摘要：為了在人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系中表達(dá)重組人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF），本研究構(gòu)建了牛β-casein基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組人GDNF乳腺上皮細(xì)胞特異表達(dá)載體，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其導(dǎo)入人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系Bcap-37細(xì)胞中，經(jīng)G418抗性篩選8～10 d后，分離穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，RT-PCR和Western Blot檢測重組人GDNF的表達(dá)分泌。結(jié)果表明：重組人GDNF乳腺上皮細(xì)胞特異表達(dá)載體被成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染Bcap-37細(xì)胞后，穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)激素誘導(dǎo)后能夠表達(dá)分泌糖基化的 GDNF，為高效制備與天然人GDNF蛋白結(jié)構(gòu)完全一致的重組人GDNF蛋白用于帕金森病臨床治療研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系；生物反應(yīng)器；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；表達(dá)載體；帕金森病

中圖分類號(hào)： Q789文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0016-04

收稿日期：2014-07-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31060304）；內(nèi)蒙古高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：NJ10184） 。

作者簡介：張學(xué)明（1970—），男，內(nèi)蒙古包頭人，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹亟M藥物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森?。≒arkinsons disease，PD）是老年人群中常見的一種神經(jīng)元退行性疾病，其臨床表現(xiàn)主要是以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和姿勢平衡障礙為特征。PD的病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退行性喪失，導(dǎo)致紋狀體中多巴胺含量顯著降低[1]。目前用于PD臨床治療的常規(guī)藥物主要有復(fù)方左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物等，這些藥物能夠暫時(shí)減輕或緩解癥狀，但不能阻止PD的進(jìn)程，且長期用于PD治療會(huì)出現(xiàn)多種并發(fā)癥[2]；因而，研制開發(fā)新的藥物用于PD的有效治療是非常必要的。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離純化出的一種分泌性糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員[3]。研究表明，GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)及保護(hù)作用[4]，應(yīng)用GDNF治療帕金森病已進(jìn)入二期臨床研究[5]。然而由于GDNF在人和動(dòng)物體中含量低，從動(dòng)物組織中分離純化GDNF用于疾病動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)研究是不現(xiàn)實(shí)的；因而，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)大量生產(chǎn)重組GDNF用于疾病動(dòng)物模型和臨床研究具有潛在的重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

本研究構(gòu)建了牛β-casein基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人GDNF基因乳腺上皮細(xì)胞高效特異表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系Bcap-37細(xì)胞，獲得了能夠表達(dá)重組人GDNF蛋白的轉(zhuǎn)基因Bcap-37細(xì)胞系，為高效制備與天然人GDNF蛋白結(jié)構(gòu)完全一致的重組人GDNF蛋白，并將其用于帕金森病臨床治療的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf為內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取試劑盒（上海舜華生物工程有限公司）、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN公司）、DNA純化試劑盒（TIANGEN公司）。

Taq Plus、Pfu DNA聚合酶購自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo（dt）、限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa產(chǎn)品。

人乳腺腫瘤上皮細(xì)胞系Bcap-37購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氫化可的松、胰島素購自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗體（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）購自Santa Cruz公司；連接了堿性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 試劑盒購自博士德公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)Bonsing等發(fā)表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]設(shè)計(jì)PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物兩端分別引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切位點(diǎn)。提取?；蚪MDNA，PCR擴(kuò)增牛β-casein基因5′端上游包括啟動(dòng)子、第1外顯子、第1內(nèi)含子及部分第2外顯子的3.6 kb調(diào)控序列，經(jīng)ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切后插入到骨架載體pP40R[7]的ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)作為gdnf cDNA乳腺特異表達(dá)的調(diào)控序列。XhoⅠ 酶切質(zhì)粒pUC-gdnf獲得人gdnf cDNA基因插入到牛β-casein基因5′端3.6 kb調(diào)控序列下游的XhoⅠ位點(diǎn)。PCR檢測gdnf cDNA的插入方向，PCR上游引物設(shè)計(jì)在載體3.6 kb調(diào)控序列上，引物序列為5′-ACTATTTCCTCATCTTCCCATTCCCAG-3′，下游引物設(shè)計(jì)在gdnf cDNA序列上，引物序列為5′-GAGCTCCAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反應(yīng)條件：94 ℃變性45 s，62 ℃復(fù)性45 s，72 ℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。正向插入將獲得598 bp的特異產(chǎn)物，反向插入則無特異性PCR產(chǎn)物。載體構(gòu)建完成后，對(duì)載體與片段連接處、牛β-casein基因5′端調(diào)控序列核心區(qū)域進(jìn)行測序。

1.2.2Bcap-37細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與篩選用含20%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） 的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)B-cap37細(xì)胞至70%～80%匯合時(shí)，消化細(xì)胞，以3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板。24 h后，按照脂質(zhì)體Lipofectamine操作說明，每孔加入2.0 μg 線性化載體DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后，消化每孔細(xì)胞接種于 100 mm 培養(yǎng)皿中，并加入濃度為300 μg/mL 的G418篩選8～10 d后，將表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆分離、擴(kuò)培、冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA，PCR檢測 gdnf cDNA是否整合到細(xì)胞基因組DNA中。PCR 上游引物：5′-GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3′，下游引物：5′-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反應(yīng)條件為：94 ℃變性45 s，58 ℃ 復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基（RPMI-1640+4 μg/mL催乳素+10 μg/mL胰島素+1 μg/mL氫化可的松），分別誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48 h 后，收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.2.5RT-PCR分析gdnf的表達(dá)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞按照RNA提取試劑盒操作說明提取RNA，以1.0 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以cDNA為模板PCR檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后是否有 gdnf 在mRNA水平的表達(dá)。PCR引物、反應(yīng)條件同“1.2.3”節(jié)。

1.2.6Western Blot 檢測 gdnf 的表達(dá)三氯乙酸法濃縮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液，Lorry法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封膜，一抗4 ℃過夜雜交，二抗室溫孵育1 h，BCIP/NBT顯色。

2結(jié)果與分析

2.1重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體的鑒定

載體物理圖譜見圖1，PCR檢測目的基因gdnf的插入方向見圖2。酶切鑒定gdnf 插入方向正確的載體，用ApaⅠ單酶切載體后，線性載體大小與預(yù)期大?。?1 507 bp）相符；用XhoⅠ酶切載體能夠獲得預(yù)期的576 bp的目的基因 gdnf 片段；用ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切載體能夠獲得預(yù)期的3.6 kb調(diào)控序列片段和576 bp目的基因gdnf 片段（圖3）。載體與片段連接處、牛β-casein基因5′端調(diào)控序列核心區(qū)域的測序結(jié)果正確（數(shù)據(jù)未顯示）。結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子、牛β-casein基因5′端調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的重組人 gdnf 乳腺特異表達(dá)載體。

2.2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定

線性化載體轉(zhuǎn)染B-cap37細(xì)胞，G418篩選8～10 d 后，獲得了表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆（圖4）。分離擴(kuò)培紅色熒光細(xì)胞，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增重組人gdnf，發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無特異條帶，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的紅熒光細(xì)胞獲得了與預(yù)期一致的特異條帶（圖5），表明重組人gdnf已整合到細(xì)胞基因組之中。

2.3gdnf 基因的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3.1RT-PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48h后提取RNA，以RNA為模板PCR擴(kuò)增 gdnf cDNA，無特異條帶產(chǎn)生，表明RNA未受基因組DNA污染；以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，PCR擴(kuò)增 gdnf cDNA基因，誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48 h的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得了558 bp特異條帶，而陰性對(duì)照無特異條帶產(chǎn)生（圖6）。結(jié)果表明牛β-casein基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)gdnf cDNA基因轉(zhuǎn)錄為mRNA。

2.3.2Western Blot檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液經(jīng)Western Blot探測，有大約15、18 ku 的2條特異帶形成，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無特異帶形成（圖7），表明 gdnf cDNA基因能夠翻譯成蛋白，而且能進(jìn)行翻譯后加工形成糖蛋白分泌到細(xì)胞外。

3結(jié)論與討論

當(dāng)前，用于疾病動(dòng)物模型和臨床研究的重組人GDNF是用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌發(fā)酵制備的[8]。用大腸桿菌生產(chǎn)的重組人GDNF不能被糖基化[8]。臨床研究表明，糖基雖然對(duì)GDNF的神經(jīng)營養(yǎng)功能不是必要的，但在帕金森?、蚱谂R床研究中，約有10%的病人由于重組人GDNF缺乏糖基化而產(chǎn)生了抗GDNF抗體的免疫反應(yīng)[9]；因而，利用大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白雖然快速經(jīng)濟(jì)，但該表達(dá)系統(tǒng)由于缺乏翻譯后修飾功能，而不適用于需要進(jìn)行翻譯后修飾的重組蛋白的生產(chǎn)。而且，已有研究表明利用大腸桿菌生產(chǎn)的重組人GDNF由于蛋

白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊而影響了其生物學(xué)功能[10]。也有研究者用昆蟲細(xì)胞和酵母菌制備重組人GDNF，這些低等真核細(xì)胞雖然可以表達(dá)糖基化的重組人GDNF，但其糖基化與天然的人GDNF的糖基化有差異[11-13]，從而在臨床研究中同樣存在安全問題。

當(dāng)前，需要進(jìn)行翻譯后修飾的重組蛋白大多用非人類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)[14]。用非人類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以表達(dá)與天然人蛋白結(jié)構(gòu)一致的重組人蛋白，但也有時(shí)候存在差異[15]；因而在治療應(yīng)用上，人們更希望利用人細(xì)胞系來生產(chǎn)與天然人蛋白結(jié)構(gòu)完全一致的重組人蛋白[16]。

本研究將人gdnf cDNA插入到3.6 kb牛β-casein基因5′端調(diào)控序列下游，并用SV40 polyA序列作為其轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，構(gòu)建了重組人 gdnf 乳腺特異表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)入人乳腺腫瘤細(xì)胞系Bcap-37中，獲得了隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，用激素誘導(dǎo)表達(dá)后在細(xì)胞上清液中檢測到了重組人GDNF蛋白。人GDNF蛋白為同源二聚體糖蛋白，單體糖蛋白18 ku，去糖基化單體約15 ku[17]。本研究從激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清液中通過Western Blot 探測到約15、18 ku的2條特異條帶，且重組人GDNF蛋白絕大部分為糖基化蛋白（圖7）。由于該重組蛋白是用人乳腺腫瘤細(xì)胞系作為反應(yīng)器制備的，因而，我們推測在人乳腺腫瘤細(xì)胞系Bcap-37中表達(dá)的18 ku重組人GDNF蛋白與天然的人GDNF相比，在結(jié)構(gòu)上應(yīng)當(dāng)沒有差異，如果用于臨床研究應(yīng)當(dāng)更具有安全性。本研究為高效制備與天然人GDNF蛋白結(jié)構(gòu)完全一致的重組人GDNF蛋白用于帕金森病臨床治療研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dauer W，Przedborski S. Parkinsons disease：mechanisms and models[J]. Neuron，2003，39（6）：889-909.

[2]謝瑞滿. 帕金森病研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)， 2003，15（7）：401-404.

[3]Lin F L，Doherty D H，Lile J D，et al. GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J]. Science，1993，260（5111）：1130-1132.

[4]Tomac A，Lindqvist E，Lin，F(xiàn) L，et al. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo[J]. Nature，1995，373（6512）：335-339.

[5]Slevin J T，Gerhardt G A，Smith C D，et al. Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. Journal of Neurosurgery，2005，102（2）：216-222.

[6]Bonsing J，Ring J M，Stewart A F，et al. Complete nucleotide sequence of the bovine beta-casein gene[J]. Australian Journal of Biological Sciences，1988，41（4）：527-537.

[7]張學(xué)明，羅奮華，蘇慧敏，等. 人gdnf基因的克隆及牛β-酪蛋白基因座定位整合載體的構(gòu)建[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2009（5）：113-118.

[8]Slevin J T，Gash D M，Smith C D，et al. Unilateral intraputamenal glial cell line-derivedneurotrophic factor in patients with Parkinson disease：response to 1 year of treatment and 1 year of withdrawal[J]. Journal of Neurosurgery，2007，106（4）：614-620.

[9]Lang A E，Gill S，Patel N K，et al. Randomized controlled trial of intraputamenal glial cell line-derived neurotrophic factor infusion in Parkinson disease[J]. Annals of Neurology，2006，59（3）：459-466.

[10]陳哲宇，何志勇，何成，等. 人GDNF結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2000，32（3）：243-247.

[11]陳哲宇，黃愛軍，何成，等. 人GDNF在甲醇酵母及家蠶幼蟲中的表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（5）：561-565.

[12]Jarvis D L，Kawar Z S，Hollister J R. Engineering N-glycosylation pathways in the baculovirus-insect cell system[J]. Current Opinion in Biotechnology，1998，9（5）：528-533.

[13]Wildt S，Gerngross T U. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast[J]. Nature Reviews Microbiology，2005，3（2）：119-128.

[14]Chu L， Robinson D K. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture[J]. Curr Opin Biotechnol，2001，12（2）：180-187.

[15]Bsze Z，Baranyi M，Whitelaw C B. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species[J]. Adv Exp Med Biol，2008，357-393.

[16]Lee S B，Park J S，Lee S，et al. Overproduction of recombinant human VEGF（vascular endothelial growth factor） in Chinese hamster ovary cells[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，18（1）：183-187.

[17]Grimm L，Holinski-Feder E，Teodoridis J，et al. Analysis of the human GDNF gene reveals an inducible promoter，three exons，a triplet repeat within the 3′-UTR and alternative splice products[J]. Human Molecular Genetics，1998，7（12）：1873-1886.

姜雪，于巍. 基于優(yōu)化特征參量的蛋白質(zhì)βαβ模體識(shí)別分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：20-23.