閆路路，秦艷杰，閆喜武，王琳楠，畢成隆，張津源

大連海洋大學(xué)， 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 大連 116023

基于轉(zhuǎn)錄組平臺的蛤仔微衛(wèi)星標記篩選

閆路路，秦艷杰，閆喜武*，王琳楠，畢成隆，張津源

大連海洋大學(xué)， 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 大連 116023

以菲律賓蛤仔轉(zhuǎn)錄組測序所得拼接序列為基礎(chǔ)，采用MISA軟件進行微衛(wèi)星分析，對其中的145個微衛(wèi)星位點進行引物設(shè)計，得到具有清晰擴增條帶的微衛(wèi)星位點58個。對大連莊河野生蛤仔群體的擴增結(jié)果表明，18個位點顯示單態(tài)性，40個位點表現(xiàn)為多態(tài)性。該群體40個多態(tài)性微衛(wèi)星位點得到的等位基因數(shù)在2—6之間，平均等位基因數(shù)為3.4250±0.9718，觀測雜合度和期望雜合度分別在0.0000—1.0000和0.0615—0.7996之間，平均值分別為0.2727±0.2272和0.4739±0.1902，群體平均Nei指數(shù)為0.4664±0.1872。多態(tài)信息含量(PIC)在0.0586—0.7529之間，平均值為0.4148±0.1707，其中16個微衛(wèi)星位點的PIC值大于0.5，為高度多態(tài)性，15個位點0.25 < PIC<0.5，為中度多態(tài)性，其余9個為低度多態(tài)性。經(jīng)Sequential Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡檢驗，有10個位點尚未偏離平衡?；谵D(zhuǎn)錄組平臺篩選微衛(wèi)星標記的方法，在很大程度上推動了DNA分子標記的開發(fā)。研究開發(fā)的微衛(wèi)星標記可用于蛤仔群體遺傳學(xué)、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及其他相關(guān)研究，為蛤仔分子標記輔助育種及群體種質(zhì)保護等工作提供技術(shù)支持。

菲律賓蛤仔；轉(zhuǎn)錄組；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)又稱蛤仔[1]，具有生長快、周期短、適應(yīng)強等特點，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，也是世界主要養(yǎng)殖貝類之一。據(jù)FAO(Food and Agriculture Organization)統(tǒng)計，2011年世界蛤仔產(chǎn)量為368多萬t。我國年產(chǎn)量約300多萬噸，占世界總產(chǎn)量的90%以上，占我國海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20%，貝類產(chǎn)量的30%[2]。現(xiàn)階段，菲律賓蛤仔正面臨著育種方式單一和病害防治難等問題，以轉(zhuǎn)錄組平臺為基礎(chǔ)，開發(fā)一系列微衛(wèi)星標記[3- 4]，可為系統(tǒng)開展蛤仔物種遺傳多樣性的研究奠定基礎(chǔ)，也將有助于蛤仔標記輔助育種工作的開展。微衛(wèi)星，又稱簡單重復(fù)序列(SSR)[5]，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點特異性、檢測方便和呈共顯性遺傳等特點[6- 7]，是廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物遺傳多樣性分析[8]、遺傳圖譜構(gòu)建[9]、雌核發(fā)育[10]、基因定位及克隆[11]、親權(quán)鑒定[12]等的理想分子標記。菲律賓蛤仔微衛(wèi)星引物的開發(fā)和遺傳多樣性分析有一系列相關(guān)報道，如閆喜武[13]等利用微衛(wèi)星標記對3個地區(qū)蛤仔群體進行遺傳多樣性分析。虞志飛等人[14]利用SSR引物查明年齡結(jié)構(gòu)對蛤仔遺傳多樣性的影響。2007年N. YASUDA[15]等人用9對引物對菲律賓蛤仔進行遺傳多樣性分析。2009年韓國學(xué)者Hye Suck An[16]等人利用13個微衛(wèi)星標記位點對菲律賓蛤仔進行遺傳多樣性研究。由于引物開發(fā)的局限，目前蛤仔尚沒有足夠的微衛(wèi)星標記用于相關(guān)遺傳學(xué)研究。

蛤仔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺可以提供大量EST(expressed sequence tags)數(shù)據(jù)，且直接與功能基因密切相關(guān)。本文將轉(zhuǎn)錄組測序所得數(shù)據(jù)用于蛤仔微衛(wèi)星標記開發(fā)、篩選和遺傳多樣性分析，此研究將為蛤仔遺傳圖譜的構(gòu)建、親權(quán)鑒定、QTL(quantitative trait locus)定位等提供批量的微衛(wèi)星位點，并為蛤仔的分子標記輔助育種和種質(zhì)保護等工作提供強有力技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗材料為采自大連莊河的32個野生菲律賓蛤仔個體。殼長為(1.5±0.2) cm。

1.2 基因組DNA的提取

分別剪取32只蛤仔的足100 mg左右，于離心管中剪碎，采用常規(guī)的酚/氯仿抽提的方法[16]提取DNA，后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量(golden view染色)。模板DNA保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.3 微衛(wèi)星序列的來源

根據(jù)羅氏454公司的Genome Sequencer (GS) 高通量測序得到的所有數(shù)據(jù)進行reads長度頻數(shù)的統(tǒng)計，使用軟件SeqClean(Lastest86_64版本)和Lucy(1.20p版本)處理原始數(shù)據(jù)，去掉接頭和引物序列，保留50 bp長度的序列。利用454 Newbler2.5.3軟件去除低質(zhì)量區(qū)域序列，將保留的50 bp長度的序列進行拼接，將拼接得到的序列用MISA軟件進行SSR分析。對于非混合型SSR位點，設(shè)置條件為單堿基類型重復(fù)至少10次，2堿基類型重復(fù)至少6次，大于等于3個堿基類型的SSR其重復(fù)單元至少重復(fù)5次。在此基礎(chǔ)上，如兩個SSR位點間距離小于100 bp，則認為這兩個SSR位點組成一個混合型SSR位點。

1.4 引物設(shè)計與合成

挑選以三堿基為重復(fù)單元的微衛(wèi)星標記序列設(shè)計引物，引物長度在18—22 bp之間，GC含量在40%—60%之間，擴增目的片段長度在100—500 bp之間，引物需在序列保守區(qū)內(nèi)。共設(shè)計145對菲律賓蛤仔微衛(wèi)星引物，并由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系(10 μL)：基因組DNA 2 ng、10×Easy Taq Buffer 1 μL(20 mmol/L Mg2+)、Easy Taq DNA 聚合酶 0.2 μL (5 units/μL)、dNTP 0.8 μL (0.2 mmol/L)、引物各0.4 μL(0.4 μmol/L)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 40 s，最適退火溫度下40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)12%的非變性聚丙烯酰胺(丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺體積比為29∶1)凝膠電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，電泳液為1×TBE緩沖液，電壓300 V，電泳時間約為2 h(北京六一儀器廠DYY-Ⅱ型電泳儀，DYCZ- 30型電泳槽)，硝酸銀染色后用凝膠成像儀成像。

1.6 菲律賓蛤仔SSR引物的篩選及遺傳多樣性分析

實驗利用12個大連莊河野生個體對145對引物進行初篩，在預(yù)設(shè)退火溫度(PP5軟件推薦溫度)±3 ℃區(qū)間內(nèi)，設(shè)置12個溫度梯，按照上述PCR反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測方法進行PCR擴增和檢測，以出現(xiàn)清晰條帶、主帶清楚為標準，篩選每對引物最適退火溫度和可用引物。

將能夠獲得清晰條帶的微衛(wèi)星位點用于野生蛤仔遺傳多樣性分析，以32個野生蛤仔DNA樣品為模板，按照上述PCR反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增，其中最適退火溫度為引物初篩得到的退火溫度。最后用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，并對擴增結(jié)果進行拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

群體擴增結(jié)果統(tǒng)計時，將每個位點所有條帶按照片段從小到大依次命名為A, B, C,…，即為等位基因，并按照每個個體的帶型統(tǒng)計出基因型。利用PopGene32軟件統(tǒng)計每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù) (Allele number,Na),觀測雜合度 (observed heterozygosity,Ho),期望雜合度 (expected heterozygosity,He) 和香農(nóng)一威納指數(shù)(Shannon-Wiener Index,H),并計算多態(tài)信息含量 (polymorphism information content, PIC)。具體參數(shù)的計算方法如下：

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星標記分析

利用MISA軟件，將拼接得到的序列進行微衛(wèi)星標記分析，結(jié)果如表1所示。

表1 SSR標記分析結(jié)果Table 1 Output statistics of SSR (simple sequence repeats)

2.2 菲律賓蛤仔SSR引物篩選結(jié)果

初篩結(jié)果中，共58對引物出現(xiàn)清晰擴增條帶，且雜帶少易于鑒別等位基因。在32個蛤仔個體中的擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18對引物表現(xiàn)為產(chǎn)物單一條帶(圖1c)，另40對引物能夠分別在32個莊河自然野生蛤仔個體中擴增出清晰、穩(wěn)定的DNA目的片段，在蛤仔野生群體中可表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，并能對其進行準確的基因分型(圖1a,b)。呈現(xiàn)多態(tài)性的40個位點中，15個位點出現(xiàn)3個等位基因，13個位點出現(xiàn)4個等位基因，7個位點出現(xiàn)2個等位基因，4個位點出現(xiàn)5個等位基因，1個位點出現(xiàn)6個等位基因。上述58對SSR引物，其退火溫度在43—59 ℃范圍內(nèi)，擴增產(chǎn)物片段大小在117—605 bp之間，均是以三堿基為重復(fù)單元的序列，其中有8個微衛(wèi)星位點以TTG為重復(fù)單元，有6個位點以TGG為重復(fù)單元，以ATC、TGT為核心序列的位點各有5個，這4種核心序列在篩選出的58個SSR位點中占41.38%，其余重復(fù)單元位點個數(shù)均小于5個位點。

2.3 菲律賓蛤仔野生群體遺傳多樣性分析

根據(jù)40對SSR引物在32個個體中擴增片段的分布情況進行統(tǒng)計，得出等位基因數(shù)(Na)在2—6之間，平均等位基因數(shù)為3.4250±0.9718，觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別在0.000—1.000和0.0615—0.7996之間，平均值分別為0.2727±0.2272和0.4739 ± 0.1902。群體平均Nei指數(shù)為0.4664±0.1872，遺傳多樣性指數(shù)為平均Shannon指數(shù)為0.8330±0.3445。多態(tài)信息含量(PIC)在0.0586—0.7529范圍內(nèi)，平均值為0.4148±0.1707，其中16個SSR位點的PIC值均大于0.5，15個位點的PIC值在0.25—0.5之間,9個位點的PIC值小于0.25。χ2檢驗Hardy-Weinberg平衡結(jié)果表明，有29個位點極顯著的偏離(P<0.01)，2個位點顯著偏離(P< 0.05)，9個位點表現(xiàn)為符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)(表2)，經(jīng)Sequential Bonferroni校正后，除Rpt23、Rpt83、Rpt111、Rpt161、Rpt163、Rpt177、Rpt188、Rpt219、Rpt254、Rpt261 10個位點，其余位點均偏離平衡。

圖1 部分引物的擴增結(jié)果Fig.1 The amplification results of some microsatellite loci

3 討論

目前，菲律賓蛤仔微衛(wèi)星開發(fā)技術(shù)比較單一，且開發(fā)數(shù)量有限。如N. YASUDA[15]等人利用雙重抑制PCR技術(shù)從菲律賓蛤仔(R.philippinarum)中分離出22對微衛(wèi)星引物，共有9對引物成功擴增出特異條帶，可用于蛤仔的微衛(wèi)星DNA標記。Hye Suck An[16]等人利用預(yù)雜交PCR擴增技術(shù)(prehybridization PCR amplification)得到13個微衛(wèi)星標記位點并對雜色蛤進行跨物種擴增，得到9對引物在菲律賓蛤仔(R.philippinarum)中有多態(tài)性，8對引物在雜色蛤(R.variegate)中呈現(xiàn)多態(tài)性。閆喜武[13]等人通過搜索NCBI中EST文庫，獲得5658個EST序列，篩選出13個蛤仔SSR序列，利用篩選出的13個SSR序列對蛤仔3個地理群體的遺傳多樣性進行研究分析，虞志飛[14]等人用上述SSR位點，對大連群體不同年齡階段的蛤仔進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明年齡結(jié)構(gòu)對蛤仔種群內(nèi)遺傳分化的影響較小。隨著蛤仔大規(guī)模養(yǎng)殖及育種工作的廣泛開展，僅有上述的微衛(wèi)星標記還遠遠不夠。轉(zhuǎn)錄組平臺的構(gòu)建，在很大程度上推動了DNA分子標記的開發(fā)。近年來利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得含有微衛(wèi)星的序列，并對其進行遺傳多樣性的研究在國際上已有成功報道[17- 19]。如2012年Hye Suck An[20]等人利用454測序系統(tǒng)篩選出22個厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)SSR位點并對其進行多態(tài)性分析；同年其同樣利用第二代測序技術(shù)在太平洋鮑魚(Haliotisdiversicolorsupertexta)中挑選出20個有多態(tài)座位的SSR標記位點[21]。可見該方法已成功應(yīng)用于大規(guī)模篩選貝類微衛(wèi)星標記位點。本文首次在蛤仔中利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)批量篩選SSR位點，篩選出具有清晰擴增條帶的58個微衛(wèi)星位點，其中40個呈現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。相比之下該方法篩選效率高，工作量相對較小，且適合大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標記位點，且開發(fā)位點可能與功能基因相關(guān)，可為后續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建，QTL定位等提供有力支持。

遺傳多樣性可用于衡量生物遺傳信息變異的程度，DNA則是遺傳信息的主要載體，所以DNA的多樣性能夠直接反映物種遺傳變異程度。群體的遺傳多樣性主要表現(xiàn)在等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量3個方面[22]。本研究中，對基于轉(zhuǎn)錄組平臺得到的145個微衛(wèi)星位點進行引物篩選，并在大連莊河野生蛤仔群體中研究其多樣性，發(fā)現(xiàn)58個位點可以擴增出清晰條帶，其中18個位點表現(xiàn)為單態(tài)性，暫不計于遺傳多樣性分析，另40個位點則表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，用于遺傳多樣性分析。得到Na= 2—6(平均值3.4250±0.9718)，Ho= 0.000—1.000(平均值0.2727±0.2272)，He= 0.0615—0.7996(平均值0.4739±0.1902)，PIC= 0.0586—0.7529(平均值0.4148±0.1707)，根據(jù)多態(tài)信息含量指標，共有16個微衛(wèi)星位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC≥ 0.5),15個位點為中度多態(tài)性(0.25 ≤ PIC<0.5)，9個位點為低度多態(tài)性(PIC<0.25)，且PIC平均值也接近于0.5，可見莊河野生蛤仔維持著較好的多樣性，能夠為蛤仔的群體結(jié)構(gòu)和其他遺傳研究做理論指導(dǎo)。與其他人研究結(jié)果相比，Hye Suck An[16]等人研究結(jié)果為Na= 9—26，He= 0.73—0.94，N. YASUDA[15]等人研究得Na= 6—22,Ho= 0.136—0.909，He= 0.553—0.954，本實驗結(jié)果均略低于以上研究數(shù)據(jù)，究其原因，作者認為可能由于微衛(wèi)星位點不同、個體間差異、生長環(huán)境迥異等非確定性因素，導(dǎo)致實驗結(jié)果與他人結(jié)果存在一定偏差，但本研究結(jié)果與閆喜武[13]2011年報道的大連野生群體Na= 3—5，Ho= 0.10—0.97，He= 0.51—0.72的結(jié)果相比差別不大，可能是由于該研究與本文中群體都來源于大連莊河，且微衛(wèi)星標記均來自于EST數(shù)據(jù)有關(guān)。

表2 32個野生蛤仔中的40個微衛(wèi)星位點的特征描述Table2 Characterization of 58 microsatellite loci in 32 wild clam

續(xù)表

Tm退火溫度: annealing temperature；Na等位基因數(shù): Allele number；Ho觀測雜合度: observed heterozygosity；He期望雜合度: expected heterozygosity；PIC多態(tài)信息含量: polymorphism information content；H香農(nóng)一威納指數(shù): Shannon-Wiener Index；Phew: 哈德-溫格平衡χ2檢驗Chi-squaretestforHardy-Weinbergequilibrium

另外統(tǒng)計得到以TTG為核心序列的位點有8個，以TGG為核心序列的位點有6個，分別以TGT和ATC為核心序列的位點各有5個(表2)，這4種核心序列在篩選出的58個SSR位點中占41.38%，在三堿基重復(fù)序列中，TTG、TGG、TGT、ATC為相對豐富的拷貝類別，且具有相對高的多態(tài)性，這為后續(xù)重復(fù)序列的篩選以及進一步了解蛤仔基因組特性提供了參考。隨著轉(zhuǎn)錄組平臺的進一步深入分析，更多與功能基因相關(guān)的微衛(wèi)星位點將被發(fā)掘出來，這將為蛤仔人工標記輔助育種提供更多的分子標記，并為蛤仔生長、抗病力、肉質(zhì)等重要經(jīng)濟性狀相關(guān)標記的篩選和定位奠定必要的基礎(chǔ)。

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Development of microsatellite markers inRuditapesphilippinarumusing next-generation sequencing

YAN Lulu, QIN Yanjie, YAN Xiwu*, WANG Linnan, BI Chenglong, ZHANG Jinyuan

EngineeringResearchCenterofShellfishCultureandBreedinginLiaoningProvince,CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian, 116023,China

Ruditapesphilippinarumhas a high growth rate, short culture cycle, and is highly adaptable. Because of these traits, it is one of China′s four major cultured shellfishes, and one of the world′s major cultured shellfishes. Microsatellites known as simple sequence repeats are widely used to assess genetic diversity in farmed aquatic species populations, construct molecular genetic maps, and carry out gynogenesis, gene mapping, gene cloning, and paternity tests. These molecular markers have high stability and polymorphism, are site-specific and easily detected, and exhibit codominant inheritance and transferability of SSR primers. At present, the sustainable culture ofRuditapesphilippinarumis threatened by having a single breeding method and difficulties with disease prevention, control, and treatment. We developed a series of microsatellite markers using a transcriptome-based platform to provide a foundation for genetic research inRuditapesphilippinarum. These markers may also be used for Ruditapes marker-assisted breeding. Genetic diversity measures the degree of variability of biological genetic information. DNA is the primary carrier of genetic information, so the diversity of DNA directly reflects the degree of genetic variation. The genetic diversity of a population can be represented by the number of alleles, heterozygosity scores, and polymorphism information content (PIC). We sequenced a large number of ESTs and screened 145 potential microsatellites of trinucleotide repeats using MISA software. We successfully obtained clear, reproducible bands for 58 microsatellite loci. These were amplified in 32 wild clam individuals sampled from Zhuanghe, Dalian, Liaoning. A single allele was detected at 18 loci and another 40 were polymorphic (number of alleles per locus ranged from 2 to 6, with an average of 3.4250±0.9718). The observed and expected heterozygosity was 0.000—1.000 (0.2727±0.2272) and 0.0615—0.7996 (0.4739±0.1902), respectively. The average of the Nei index was 0.4664±0.1872. The polymorphism information content (PIC) of all loci ranged from 0.0586 to 0.7529 (0.4148±0.1707). Among these, 16 loci had a PIC of >0.5, so were classified as highly polymorphic. An additional 15 loci were moderately polymorphic withPICsranging from 0.25 to 0.5. The PIC of 9 loci was <0.25, meaning that these were classified as low polymorphic loci. Using a test of the Hardy-Weinberg principle (χ2test) and sequential Bonferroni calibration, all except 10 loci had deviated equilibrium. Eight loci had a core sequence of TTG, 6 had a core sequence of TGG, and 5 each had a core sequence of TGT or ATC. These four core sequences accounted for 41.38% of the 58 SSR screened loci. Based on this, we infer that TTG, TGG, TGT, and ATC are relatively abundant copy categories of the trinucleotide repeat sequences. Our results provide a reference for subsequent repetitive sequence screening and further understanding the characteristics of the Ruditapes genome. Microsatellite marker development by transcriptome sequencing proved to be efficient and feasible inR.philippinarum. Further in-depth analysis based on transcriptome analysis will likely yield more microsatellite sites which are associated with functional genes, thereby providing more molecular markers for Ruditapes artificial marker-assisted breeding. These polymorphic markers may also be used in future studies of population genetics, linkage mapping and assisted breeding inR.philippinarum.

Ruditapesphilippinarum; transcriptome sequencing; microsatellite markers; genetic diversity

國家863計劃(2012AA10A410- 2); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助(CARS- 48)

2013- 05- 15;

日期:2014- 04- 17

10.5846/stxb201305151071

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yanxiwu2002@163.com

閆路路，秦艷杰，閆喜武，王琳楠，畢成隆，張津源.基于轉(zhuǎn)錄組平臺的蛤仔微衛(wèi)星標記篩選.生態(tài)學(xué)報,2015,35(5):1573- 1580.

Yan L L, Qin Y J, Yan X W, Wang L N, Bi C L, Zhang J Y.Development of microsatellite markers inRuditapesphilippinarumusing next-generation sequencing.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1573- 1580.