姚曉敏，倪銘，李越，魏玲，林愛(ài)斌，李宏偉(浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江寧波 3500；北京市理化分析測(cè)試中心)

?

橙皮苷對(duì)四環(huán)素所致小鼠脂肪肝的保護(hù)作用

姚曉敏1，倪銘1，李越2，魏玲2，林愛(ài)斌1，李宏偉1(1浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100；2北京市理化分析測(cè)試中心)

摘要：目的觀察橙皮苷對(duì)四環(huán)素引起小鼠非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用。方法將ICR小鼠分為A、B、C組，A組給予橙皮苷(300 mg/kg)連續(xù)灌胃10 d，B、C組給予同體積溶劑；在第10天給藥后1 h時(shí)A、B組腹腔注射四環(huán)素200 mg/kg 20 mL，C組給予相同pH值等體積生理鹽水。給毒后24 h眼球取血，并取肝臟，檢測(cè)血清ALT、AST、TG、TC及肝組織TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酯(SOD)、谷胱甘肽(GSH)，HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)改變。結(jié)果與C組比較，B組血清ALT、AST升高而TG、TC降低，肝組織中TG、TC、MDA、GSH升高，P均<0.05；與B組比較，A組血清ALT、AST降低而TG、TC升高，肝組織中TG、TC降低而GSH升高，P均<0.05。C組小鼠肝臟未見(jiàn)明顯病變，B組動(dòng)物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、水樣變性等病理改變。A組給藥可減輕上述病理改變。結(jié)論橙皮苷對(duì)四環(huán)素所致小鼠脂肪肝具有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝；橙皮苷；四環(huán)素；甘油三酯；膽固醇

研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率在迅速增加，已成為一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]；其常見(jiàn)病因有肥胖、糖尿病、化學(xué)毒物和藥物等[2～6]，但發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，且無(wú)療效確切的治療藥物。橙皮苷是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，廣泛存在于豆科、唇形花科、碟形花科、蕓香科、柑橘屬植物中。2013年9月～2014年2月，我們觀察了橙皮苷對(duì)四環(huán)素所致小鼠NAFLD是否有保護(hù)作用，為橙皮苷的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠30只，雄性，體質(zhì)量20～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司；實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于屏蔽級(jí)動(dòng)物房，每日明暗室各12 h，恒溫恒濕，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。藥品和試劑：鹽酸四環(huán)素(CAS)購(gòu)自Ameresco公司，ALT、AST、TG、TC、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；橙皮苷(95%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，聯(lián)苯雙酯滴丸(批號(hào)：13010104)購(gòu)自北京市地壇醫(yī)院；其他試劑均為分析純化學(xué)試劑。實(shí)驗(yàn)儀器：電子顯微鏡(80i，Nikon)，超聲波清洗器(SB25-120，寧波新芝生物科技)，勻漿機(jī)(IKA T10，basic)，加熱制冷水浴槽(GD120-S12，Grant)，電子天平(LA5002，上海精天電子儀器公司)，多功能酶標(biāo)儀(varianscan Flash，Thermo)，超級(jí)恒溫水浴鍋(HH601，金壇科興)，酸度計(jì)(PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器廠)，高速離心機(jī)(TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模小鼠隨機(jī)分為A、B、C組各10只，A組給予橙皮苷(300 mg/kg)連續(xù)灌胃10 d，B、C組給予同體積溶劑；在第10天給藥后1 h時(shí)，A、B組腹腔注射四環(huán)素200 mg/kg 20 mL，C組給予相同pH值等體積生理鹽水。給毒后24 h眼球取血，并取肝臟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2血清ALT、AST、TG、TC測(cè)定小鼠腹腔注射四環(huán)素后24 h眼球取血，3 500 r/min離心10min，分離血清，檢測(cè)血清ALT、AST、TG、TC。

1.2.3肝組織TG、TC測(cè)定小鼠眼球取血后取肝臟，取同一部位肝組織；于冰浴上以無(wú)水乙醇制成10%肝勻漿，2 500 r/min離心10 min；取上清液，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定肝組織中的TG、TC。

1.2.4肝組織MDA、SOD、GSH測(cè)定取同一部位肝組織，于冰浴上以生理鹽水制成10%肝勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定肝組織中的MDA、GSH、SOD。

1.2.5肝組織病理學(xué)觀察取肝臟大葉同一部位組織，以10%甲醛固定；HE染色后，顯微鏡下觀察肝細(xì)胞是否出現(xiàn)壞死、水樣變變性，脂肪樣變性，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。

2結(jié)果

2.1各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC比較見(jiàn)表1。

組別ALT(U/L)AST(U/L)TC(mg/dL)TG(mg/dL)A組23.28±6.22#30.13±4.62#140.26±17.56#88.50±44.83#B組49.07±16.20*38.68±5.41*111.32±24.52*37.86±19.06*C組12.80±2.3826.27±7.02189.36±32.41106.12±19.01

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05。

2.2各組小鼠肝組織中TC、TG比較見(jiàn)表2。

組別TC(mmol/g)TG(mmol/g)A組29.16±7.69##179.61±51.94#B組43.09±5.55*263.12±51.34*C組33.23±2.99106.00±15.70

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3各組小鼠肝組織中MDA、SOD、GSH比較見(jiàn)表3。

表3　各組小鼠肝組織中MDA、SOD、GSH

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.01。

2.4各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變C組小鼠肝臟未見(jiàn)明顯病變，B組動(dòng)物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、水樣變性等病理改變，A組給藥可減輕上述病理改變。見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖6。

3討論

橙皮苷分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，有酸性，有親水性，屬黃酮物質(zhì)的黃烷酮。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗過(guò)敏、降低膽固醇、保肝、降血壓、抗腫瘤等藥理作用[6～8]，還能清除生物體的自由基，提高機(jī)體免疫力。李慧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷能極顯著地降低蛋黃乳所致高脂血癥小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，并能升高HDL-C。因此，橙皮苷具有顯著的降血脂作用。但是，橙皮苷對(duì)四環(huán)素所致NAFLD的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

四環(huán)素是引起NAFLD的藥物之一，可誘發(fā)小泡性脂肪肝。其發(fā)生機(jī)制主要是損傷線粒體脂肪酸β氧化，降低微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白活性，從而抑制肝臟極低密度脂蛋白(VLDL)釋放[10，11]。本研究結(jié)果顯示，單劑量四環(huán)素小鼠腹腔注射能夠引起肝臟脂肪變性，表現(xiàn)為血清AST和ALT明顯升高、TC和TG顯著降低，肝組織脂質(zhì)TC和TG明顯聚積，肝細(xì)胞出現(xiàn)小泡性脂質(zhì)聚集、水樣變性和壞死，上述結(jié)果均可反映四環(huán)素誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)脂肪肝的早期變化。而橙皮苷預(yù)防給藥能抑制四環(huán)素所致小鼠血清ALT和AST水平升高、調(diào)節(jié)降低的TG和TC濃度、抑制肝臟TG和TC的蓄積，改善肝臟組織病理學(xué)損傷，從而保護(hù)四環(huán)素所引起的NAFLD。

本研究結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射四環(huán)素后肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA明顯增多，抗氧化物GSH含量出現(xiàn)升高，可考慮為抗氧化物的升高屬于代償性，以利于自由基清除。而橙皮苷預(yù)防給藥對(duì)MDA增多的抑制不明顯，但是可進(jìn)一步升高抗氧化物GSH水平。由此推測(cè)，橙皮苷保護(hù)四環(huán)素引起小鼠脂肪肝部分與其抗氧化作用相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kelishadi R, Poursafa P. Obesity and air pollution: global risk factors for pediatric non-alcoholic fatty liver disease [J]. Hepat Mon, 2011,11(10):794-802.

[2] Lee S, Bacha F, Gungor N, et al. Comparison of different definitions of pediatric metabolic syndrome: relation to abdominal adiposity, insulin resistance, adiponectin, and inflammatory biomarkers [J]. J Pediatr, 2008,152(2):177-184.

[3] 王仁萍,王燕,王偉,等.中青年脂肪肝人群高危因素分析[J].山東醫(yī)藥,2009,49(33):83-84.

[4] Browning JD, Szczepaniak LS, Dobbins R, et al. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: impact of ethnicity [J]. Hepatology, 2004,40(6):1387-1395.

[5] Farrell GC. Non-alcoholic steatohepatitis: what is it, and why is it important in the Asia-Pacific region[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2003,18(2):124-138.

[6] 李海濤,張志堅(jiān).非酒精性脂肪肝基因多態(tài)性研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2009,49(7):110-112.

[7] 李雄英,陳素紅,呂圭源.橙皮苷對(duì)脂肪乳劑致高脂血癥模型大鼠血脂及血液流變學(xué)的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,37(3):308-312.

[8] 李榮,李俊,胡成穆,等.橙皮苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào),2008,24(4)：494-498.

[9] 李慧,楊中林.橙皮苷降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2010,38(1):23-24.

[10]Letteron P, Fromenty B, Terris B, et al. Acute and chronic hepatic steatosis lead to in vivo lipid peroxidation in mice [J]. J Hepatol, 1996,24(2):200-208.

[11] Lettéron P, Sutton A, Mansouri A, et al. Inhibition of microsomal triglyceride transfer protein: another mechanism for drug-induced steatosis in mice [J]. Hepatology, 2003,38(1):133-140.

(收稿日期：2014-08-21)

中圖分類號(hào)：R963

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)04-0028-02

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.010

基金項(xiàng)目：浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201122579)；浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校2011年度重點(diǎn)課題項(xiàng)目(ZPCSR2011001)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014R433004)；浙江省寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012A610 245)。