王雷雷，馮 晉，余中華,3，劉家揚,3，李恩中,3，蔣金鋒

（1.黃淮學(xué)院生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.駐馬店市畜牧局，河南 駐馬店 463000；3.黃淮學(xué)院發(fā)酵工程實驗教學(xué)示范中心，河南 駐馬店463000；4.正陽縣新天地草業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

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不同真菌發(fā)酵對花生秸稈發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)指標(biāo)及水解效率的影響

王雷雷1，馮 晉2，余中華1,3，劉家揚1,3，李恩中1,3，蔣金鋒4

（1.黃淮學(xué)院生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.駐馬店市畜牧局，河南 駐馬店 463000；3.黃淮學(xué)院發(fā)酵工程實驗教學(xué)示范中心，河南 駐馬店463000；4.正陽縣新天地草業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

摘 要：以花生秸稈為材料，采用從駐馬店置地公園分離得到的6種大型真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和粗灰分等營養(yǎng)成分的含量以及發(fā)酵產(chǎn)物在纖維素酶作用下的水解效率進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，與對照相比，菌株L3、L4和L11可以提高產(chǎn)物粗蛋白含量，增幅達(dá)30％以上；L11和L3菌株分別使粗脂肪含量提高了1.4和0.4個百分點；真菌PG處理花生秸稈后提高了產(chǎn)物粗纖維的相對含量（約10 ％），其他菌株則降低了粗纖維的含量；花生秸稈中粗灰分的含量在真菌處理后都明顯降低，平均降幅達(dá)50％。不同pH值的緩沖液以及不同量的酶，都會影響花生秸稈的水解效率；當(dāng)緩沖液pH值為5.4，酶量為6.1 U/g秸稈時，L11處理的花生秸稈水解效率最高，達(dá)到50％。

關(guān)鍵詞：花生秸稈；真菌；固體發(fā)酵；營養(yǎng)指標(biāo)；水解效率

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，養(yǎng)殖業(yè)在其中扮演著重要角色。近年來，為了發(fā)展節(jié)糧型畜牧養(yǎng)殖業(yè)，避免出現(xiàn)人畜爭糧的局面，各單位利用秸稈積極開發(fā)非常規(guī)飼料。對秸稈等的重復(fù)利用意義重大，一方面可增加家畜的飼料來源，降低養(yǎng)殖業(yè)的成本，增加農(nóng)民收入；另一方面還可避免秸稈焚燒帶來的環(huán)境污染，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。目前，以玉米秸稈[2-4]、高粱秸稈[5]、麥麩[6]等為材料發(fā)酵研制動物飼料的報道較多，但以花生秸稈為材料的報道較少。

花生是我國北方地區(qū)的主要油料作物，其秸稈的年產(chǎn)量約2 700萬～3 000萬 t/a[7]，是一種供應(yīng)量巨大的纖維素預(yù)混料來源。目前，對花生秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物的利用率很低，大部分被就地焚燒，造成極大的資源浪費和環(huán)境污染[8-9]。而且，花生秸稈中富含纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等成分，直接作為動物飼料時，其被動物消化利用的效率較低。有研究稱，利用真菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)預(yù)處理植物類廢棄物，可將其轉(zhuǎn)化為方便動物攝取的飼料，但處理效果受到真菌及原材料種類的影響[10]。因此，研究以花生秸稈為材料，通過不同真菌發(fā)酵處理，分析發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)價值和水解效率，以期為秸稈飼料的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1花生秸稈 新鮮花生秸稈：2013年10月取自駐馬店市驛城區(qū)郊區(qū)農(nóng)田，用自來水沖洗表面可溶性物質(zhì)，并在60℃條件下烘干48 h，然后剪成大約2cm長度備用。

1.1.2真菌菌株 采自駐馬店市驛城區(qū)置地公園不同真菌的子實體，經(jīng)分離純化后獲得：L2、L4、L9和L11，尚未進(jìn)行分子鑒定；平菇真菌（簡稱PG）購于當(dāng)?shù)爻?；L3為生產(chǎn)胞外漆酶的血紅密孔菌[11]。

1.1.3培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然。

1.1.4主要試劑和儀器 試驗主要試劑有3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉等（國產(chǎn)分析純）和中性纖維素酶（河南仰韶生化工程有限公司）。主要儀器有DHG-924OA型鼓風(fēng)干燥箱（常州諾基儀器）、111二兩高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制造）、LHS-150H恒溫恒濕培養(yǎng)箱（鄭州生元儀器）、LDZM-50KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械）和INESA可見分光光度計（上海儀電分析儀器）。

1.2試驗方法

1.2.1菌種培養(yǎng)、活化與制備 菌體培養(yǎng)：將采摘的5種菌體分別在無菌條件下取菌絲，接種到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d，再將菌絲轉(zhuǎn)接新鮮平板獲得純培養(yǎng)。菌種活化：將4℃冰箱保存的純菌種L3轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2花生秸稈的固態(tài)發(fā)酵 分別從已活化的PDA培養(yǎng)基上取2～3塊0.5 cm×0.5 cm大小的菌種塊，接種到滅菌后的花生秸稈培養(yǎng)基（121℃，20 min，含水量約30 ％，花生秸稈為唯一培養(yǎng)基成分），32℃培養(yǎng)10 d，完成秸稈的真菌預(yù)處理。以不發(fā)酵的花生秸稈為對照（control）。

1.2.3發(fā)酵產(chǎn)物胞外漆酶提取與測定取長滿菌體的花生秸稈加入蒸餾水，水量以全部淹沒花生秸稈為宜，浸泡2 h，然后抽提液體，通過2,6-二甲氧基苯酚（DMP）法測定液體中胞外漆酶活力[12]，以U/g花生桿表示。

1.2.4發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)指標(biāo)測定 將剩余的固體樣品，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，60℃烘48 h，將烘干的花生秸稈放入粉碎機內(nèi)粉碎30 s，過40目篩，最后分裝入廣口瓶，貼上標(biāo)簽備用。采用半微量凱氏定氮法[13]、索式提取法[11]、植物類食品中粗纖維的測定方法[14]和飼料中粗灰分的測定方法[15]分別測定固體樣品中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和粗灰分的含量。

1.2.5不同條件下發(fā)酵后固體樣品纖維素水解效率的測定 分別稱取0.2 g發(fā)酵后的固體樣品于3支25 mL比色管中，加入1.5 mL的緩沖液（pH=5.4或pH=7.0），置于50 ℃水浴鍋中平衡10 min，然后依次在3支試管中加入2.3 U/g花生桿、4.6 U/g花生桿和6.1 U/g花生桿的中性纖維素酶，再分別加入5 mL蒸餾水；電磁振蕩3～5 s，再置于50℃水浴鍋中保溫60 min，然后加入2.0 mL DNS試劑，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL；在波長540 nm處測定吸光度，通過葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算花生秸稈在pH值為5.4與7.0的緩沖液與不同酶量條件下，釋放出還原糖的量（mg/mL）。水解效率（％）=還原糖的量/花生秸稈的量。每個試驗做3個平行，計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用二硝基水楊酸比色定糖法（DNS）測定酶解產(chǎn)物的還原糖的含量[16]，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別用pH值5.4和7.0的檸檬酸緩沖液配制成不同濃度的葡萄糖溶液，在波長540 nm處測定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1　不同緩沖液下的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（a，pH=5.4；b，pH=7.0）

2　結(jié)果與分析

2.1不同真菌發(fā)酵對花生秸稈中營養(yǎng)指標(biāo)的影響

2.1.1粗蛋白 粗蛋白質(zhì)是常規(guī)飼料分析中的一項重要指標(biāo)。由圖2可知，原始花生秸稈（control）中粗蛋白含量為5.8％，5個菌株（L2, L3, L4, L11, PG）發(fā)酵處理的花生秸稈，粗蛋白的含量均有一定變化，尤其是L3菌株處理的花生秸稈，其粗蛋白含量增加至8.2％左右，較對照組提高了約41％；另外，L4和L11菌種處理的花生秸稈，其粗蛋白含量增加至7.6％左右；只有L9菌種處理的花生秸稈中粗蛋白含量不增反減，約比對照組低17％。由此可見，經(jīng)真菌處理的花生桿，在粗蛋白的含量上存在明顯差異。

圖2　不同真菌發(fā)酵后花生秸稈中粗蛋白含量的變化

2.1.2粗脂肪 粗脂肪是一種高熱值營養(yǎng)成分，雖然動物對其需要量不高，但亦不能缺少，其在提高飼料的適口性、加快動物增重速度和飼料的利用率等方面發(fā)揮了重要作用。從圖3中可以看出，經(jīng)L2、L9和PG菌株處理的花生秸稈，其粗脂肪的含量低于對照組。這說明這3個菌種在發(fā)酵花生秸稈時，需要從花生秸稈中吸收利用粗脂肪。而L11和L3菌種處理的花生秸稈粗脂肪含量分別比對照提高1.4和0.4個百分點。由此可知，不同真菌發(fā)酵對花生秸稈粗脂肪含量的影響存在明顯差異。

圖3　不同真菌發(fā)酵后花生秸稈中粗脂肪含量的變化

2.1.3粗纖維 纖維廣泛存在于植物體內(nèi)，是植物食品的主要成分之一，它們能促進(jìn)動物胃腸道蠕動，改善消化系統(tǒng)機能，還能被動物消化吸收，提供能量來源。如圖4所示，原始花生秸稈中的粗纖維含量為43.8％，真菌發(fā)酵后其含量有輕微的變化。PG處理的花生秸稈中粗纖維的含量比對照提高了5.9個百分點，L2、L3、L4、L9和L11處理的花生秸稈粗纖維分別比對照降低6.4、4.7、3.9、0.6和5.8個百分點。這表明在固態(tài)發(fā)酵過程中，真菌會降解秸稈中的木質(zhì)素及纖維素，但不同真菌對木質(zhì)纖維素的降解能力不同[17]。

2.1.4粗灰分 飼料常規(guī)檢測中的粗灰分是指經(jīng)高溫灼燒后的殘留物質(zhì)。粗灰分的含量是評價營養(yǎng)成分的參考指標(biāo)，其中含有大量礦物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體生理機能的作用。如圖5所示，固體發(fā)酵后花生秸稈中的粗灰分都比對照低，平均降幅達(dá)50％。這是因為真菌在花生秸稈上生長，會利用所產(chǎn)酶系將部分木質(zhì)纖維素降解，轉(zhuǎn)化為自身組成部分；同時，真菌還會將一些水不溶性的礦物質(zhì)釋放出來，進(jìn)入胞外酶液中，導(dǎo)致真菌處理后的固體樣品中的粗灰分含量明顯降低。不同菌種處理的花生秸稈，粗灰分含量表現(xiàn)出一定差異，這說明不同菌種對花生秸稈的利用程度不一致。

圖4　不同真菌發(fā)酵后花生秸稈中粗纖維含量的變化

圖5　不同真菌發(fā)酵后花生秸稈中粗灰分含量的變化

2.2不同條件對發(fā)酵后固體樣品纖維素水解效率的影響

采用不同pH值的緩沖溶液，加入不同量的酶，測定花生秸稈纖維素的水解效率，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)菌種處理后的花生秸稈，水解出的糖含量有較為明顯的差異。當(dāng)緩沖液pH值為5.4時（圖6a），L11菌種處理的花生秸稈纖維素水解效率最高，酶量為6.1 U/g秸稈時，纖維素水解效率高達(dá)50％；當(dāng)緩沖液pH值為7.0時（圖6b），L2菌種處理的花生秸稈纖維素水解效率最高，比對照組提高約10個百分點。由此可知，真菌發(fā)酵處理后，花生秸稈的纖維素水解效率明顯提高，但菌種之間有一定差異。

2.3不同真菌發(fā)酵對胞外漆酶分泌的影響

在花生秸稈固體發(fā)酵過程中，真菌能分泌胞外酶蛋白，主要包括木質(zhì)素降解酶系和纖維素降解酶系，其中木質(zhì)素降解酶系包括漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶及錳過氧化物酶。通過對胞外漆酶的測定發(fā)現(xiàn)（圖7），不同真菌分泌漆酶的能力不同；其中，以L9和L3分泌能力最高，發(fā)酵液中漆酶活力分別達(dá)到2 U/g與1.6 U/g；而PG、L4和L2分泌的胞外漆酶較少，活力均低于1 U/g；菌株L11幾乎不分泌胞外漆酶。有研究表明，漆酶是真菌降解植物類材料木質(zhì)素的關(guān)鍵酶[18]。

圖6　不同緩沖液條件下各真菌對花生秸稈的水解效率（a，pH=5.4；b，pH=7.0）

圖7　不同真菌發(fā)酵對胞外漆酶分泌的影響

3　結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，不同真菌處理的花生秸稈，其營養(yǎng)指標(biāo)存在差異。與對照相比，菌株L3、L4和L11可以提高產(chǎn)物粗蛋白含量，增幅達(dá)30％以上；L11和L3菌株分別使粗脂肪含量提高了1.4和0.4個百分點；真菌PG處理花生秸稈后提高了產(chǎn)物粗纖維的相對含量（約10 ％），其他菌株則降低了粗纖維的含量；花生秸稈中粗灰分的含量在真菌處理后都明顯降低，平均降幅達(dá)50％。在水解效率方面，不同pH值的緩沖液以及不同量的酶，都會影響花生秸稈的水解效率，當(dāng)緩沖液pH值為5.4，酶量為6.1 U/g秸稈時，L11處理的花生秸稈水解效率最高，達(dá)到50％。生產(chǎn)實踐中，需根據(jù)菌株的特性，選擇一種或多種菌株同時處理花生秸稈，以提高秸稈飼料的利用率。

纖維素類物質(zhì)是地球上最為豐富的再生資源，花生秸稈中含有較高的纖維素，找到切實可行的方法處理花生秸稈，是提高纖維素利用率的關(guān)鍵。真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維類物質(zhì)最有效的微生物[18]。試驗結(jié)果表明，6種不同真菌對花生秸稈進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)成分發(fā)生了明顯變化，同時水解效率和胞外酶的分泌能力也得到了不同程度的提升。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Nutritive Value and Hydrolysis Efficiency of Fungi Fermented Peanut Straw’s Products

WANG Lei-lei1，F(xiàn)ENG Jin2，YU Zhong-hua1,3，LIU Jia-yang1,3，LI En-zhong1,3，JIANG Jin-feng4
（1.Department of Bioengineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000, PRC; 2.Animal Husbandry Bureau of Zhumadian City, Zhumadian 463000, PRC; 3.Experiment and Teaching Demonstration Center for Fermentation Engineering, Huanghuai University,Zhumadian 463000, PRC; 4.Zhengyang Xintiandi Grass Industry Co., Ltd., Zhumadian 463000, PRC）

Abstract：This study was conducted to determ ine the fungal solid fermentation effects on crude protein, fat, cellulose and ash content as well as the subsequent cellulase-acted hydrolysis efficiency of peanut straw fermented w ith 6 kinds of fungi isolated from Zhidi Garden in Zhumadian.The results showed that the fungus L3, L4 and L11 could increace the crude protein content by 30％, the L11 and L3 increased the crude fat content by 1.4 and 0.4 percentage points, respectively, as compared w ith the control; the PG-treated straw had a higher crude cellulose content by 10％ than the control while other treatments lowered the cellulose content; and all the treatments were found to decrease the crude ash content by 50％ averagely.The enzymatic hydrolysis efficiency of the peanut straw could be influenced w ith pH values and enzyme dosages; and the L11 treatment led to the highest hydrolysis efficiency of approximately 50％ when exposed to the cellulase dosage at 6.1 U/g straw and the buffer solution at pH 5.4.

Key words：peanut straw; fungus; solid fermentation; nutritive value; hydrolysis efficiency

中圖分類號：S816.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）12-0001-04

通訊作者：余中華，劉家揚

作者簡介：王雷雷（1992-），男，河南登封市人，碩士研究生，主要從事發(fā)酵飼料方面的研究。

基金項目：黃淮學(xué)院青年教師科研能力提升計劃項目（201512703）

收稿日期：2015-07-18

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.12.001