張彥榮，王志波，畢偉，張文濤，呂璐

(1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，石家莊050000;2河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院; 3中山大學中山醫(yī)學院)

骨骼肌缺血再灌注損傷在臨床上很常見，再灌注損傷不僅可以導(dǎo)致局部組織第二次打擊，還能導(dǎo)致遠隔器官(如腎、肺等)的繼發(fā)性的損傷［1］。細胞間黏附分子1(ICAM-1)屬免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附及中性粒細胞穿過血管壁的過程，是缺血再灌注損傷中的重要的炎性介質(zhì)，可激活一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO)，造成組織損傷［2］。氨基胍(AG)是iNOS的抑制劑，研究表明，AG主要通過抑制iNOS的活性進而減少NO的產(chǎn)生而起作用［3］。2013年1～5月本實驗采用AG進行治療，通過觀察ICAM-1、NO的變化及肺組織損傷情況，進一步探求AG在骨骼肌缺血再灌注肺損傷中作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wister大鼠24只，體質(zhì)量200 g左右，由本校實驗動物中心提供。AG購自Sigma公司，ICAM-1免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，NO、乳酸脫氫酶(LDH)、髓過氧化物酶(mpo)，檢測試劑盒購自碧云天生物工程有限公司，Trlzol RNA提取試劑Invitrogen公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、核糖核酸酶抑制劑、dNTP、Taq DNA聚合酶、隨機引物及瓊脂糖均為美國Promega公司產(chǎn)品;熒光定量試劑盒購自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將24只大鼠隨機分為4組，每組6只，Ⅰ組為對照組，僅進行常規(guī)麻醉，不阻斷后肢血流(10 h后取材);Ⅱ組為缺血組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h，不行再灌注;Ⅲ組為I/R組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h再灌注6 h;Ⅳ組為I/R+AG組，即阻斷后肢動脈致缺血4 h再灌注6 h，再灌注開始時經(jīng)尾靜脈注射AG注射液(150 mg/kg)［4］。

1.2.2 模型制備方法 20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，止血帶捆扎兩側(cè)大腿根部，使兩后肢缺血4 h后去除止血帶實現(xiàn)再灌注［5］，各組設(shè)定時間處理動物，分別取材。

1.2.3 血清LDH、NO及肺組織MPO檢測 各組大鼠實驗結(jié)束時經(jīng)心臟穿刺取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清LDH含量，用Bio Tek ELX800酶標儀嚴格按照NO檢測試劑盒進行NO檢測，取肺組織勻漿并用ELISA檢測試劑盒檢測肺組織中MPO含量。

1.2.4 肺組織ICAM-1蛋白表達檢測 對4組肺組織進行免疫組化染色，肺泡上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。ICAM-1陽性判斷標準參考文獻［6］。計數(shù)5個高倍視野，按照染色強度計分:0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;按陽性細胞所占百分比計分:無陽性細胞計0分，≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，＞76%計4分;二者計分相乘0～2分為(－)，≥3分為(+)。

1.2.5 肺組織ICAM-1基因表達檢測 采用RTPCR法檢測 4組肺組織 ICAM-1基因的相對表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以s表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清LDH、NO及肺組織MPO比較 見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

表1 各組大鼠血清LDH、NO及肺組織MDO比較(s)

注:與Ⅰ組比較，*P＜0.05;與Ⅲ組比較，△P＜0.05。

Ⅰ組＊△

2.2 各組肺組織ICAM-1蛋白表達比較 Ⅰ組肺泡上皮細胞未見陽性表達;Ⅱ組肺泡上皮細胞呈淡黃色顆粒狀;Ⅲ組肺泡上皮細胞見棕褐色顆粒，呈強陽性表達;Ⅳ組陽性產(chǎn)物表達明顯減輕。見插頁Ⅲ圖7。

2.3 各組ICAM-1基因在肺組織中相對表達量比較 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組ICAM-1基因相對表達量分別為0.75±0.18、4.0±0.56、13.6±1.56和6.99± 1.59。Ⅰ組ICAM-1表達不明顯，在Ⅱ、Ⅲ組呈上升趨勢，Ⅳ組表達下調(diào)，其余3組與I組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05);Ⅳ組與Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

目前認為，缺血再灌注導(dǎo)致肺損傷的機制之一為依賴中性粒細胞的途徑［7］。ICAM-1介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮細胞相互黏附，是白細胞聚集、活化和釋放炎性介質(zhì)的關(guān)鍵［8］。在組織缺血再灌注情況下，大量的過氧化物和超氧自由基產(chǎn)生，而自由基和NO是缺血再灌注損傷中的重要因素［9］，二者可激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB具有與某些基因啟動子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄的功能，涉及各種信號機制的激活以及相應(yīng)的細胞效應(yīng)的產(chǎn)生［10］。造成包括ICAM-1在內(nèi)的炎性介質(zhì)的大量表達，使中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附，且穿越血管內(nèi)皮細胞到達周圍組織，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。中性粒細胞中存在MPO，每個細胞中所含的酶的量是一定的，MPO是中性粒細胞標志性的酶，因此，組織中MPO可反映中性粒細胞的浸潤程度［11］。

本研究中，在缺血組及缺血再灌注組，肺組織MPO量及ICAM-1表達增強，說明缺血再灌注肺損傷時，中性粒細胞及炎性因子作用存在。iNOS是催化合成一氧化氮的酶，左旋精氨酸在iNOS的催化下合成NO，它與活性氧自由基反應(yīng)生成具有細胞毒性的超氧亞硝酸離子(ONOOˉ)，對組織器官造成損害。AG是iNOS的抑制劑，可使iNOS活性降低，進而減少NO等氧自由基的產(chǎn)生［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，AG治療組不但血清中NO量下降，而且ICAM-1的表達及相對表達量均下降，因此可以推斷，骨骼肌缺血再灌注肺損傷時AG可能通過減少氧自由基的產(chǎn)生，部分地阻止了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，打斷了炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)，使ICAM-1的表達下降，從而減輕了肺臟的缺血再灌注損傷。

［1］王艷蕾，崔國金，蔡慶艷，等.參麥注射液對腸缺血再灌注肺脂質(zhì)過氧化損傷的影響［J］.天津醫(yī)藥，2010，38(11):986-989.

［2］汪燕，馬傳榮，賀國芳，等.川芎嗪對大鼠腎缺血再灌注后核因子-κB表達與一氧化氮合酶活性的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27(2):128-131.

［3］王雷，唐浩勛.不同劑量氨基胍對內(nèi)毒素休克兔模型心血管功能的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(15):49-50.

［4］王文安，王根發(fā)，周永煒，等.氨基胍對大鼠腦缺血再灌注損傷及血腦屏障的影響［J］.上海交通大學學報，2006，26(7): 755-757.

［5］張連元，楊林.生理科學實驗教程［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2001:29-30.

［6］許良中，楊文濤.免疫組織化學反應(yīng)結(jié)果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

［7］張瑋瑋，郭富全，郭永清.雙下肢缺血預(yù)處理對大鼠肺臟損傷的影響［J］.中國藥物與臨床，2011，11(9):1017-1019.

［8］夏康，李家兵，吳建偉，等.丹紅注射液對大鼠移植腎缺血再灌注損傷后ICAM-1表達的影響［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2010，35(2):199-201.

［9］黃邵洪，覃杰，榮健，等.控氧灌注對體外循環(huán)犬肺缺血—再灌注損傷的保護作用［J］.新醫(yī)學，2012，43(11):808-810.

［10］Mera S，Tatulescu D，Cismaru C，et al.Multiplex cytokine profiling in patients with sepsis［J］.APMIS，2011，119(2):155-163.

［11］Baines CP.How and when do myocytes die during ischemia and reperfusion:the late phase［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2011，16(3-4):239-243.

［12］王露茜，賈靜，郭明發(fā)，等.L-精氨酸、氨基胍和瓜丁胺在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1213-1217.