曲巍，于波

(1沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院，沈陽(yáng)110016;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

心肌纖維化(MF)是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是高血壓左心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)［1］。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))激活、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增高是導(dǎo)致MF的主要原因［2］。2012年9月～2013年9月，本研究觀察新型醛固酮抑制劑依普利酮對(duì)自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠MF的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 雄性SHR大鼠28只，SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機(jī)分為4組，即依普利酮組、替米沙坦組、聯(lián)合組及對(duì)照組，每組7只。分別采用灌胃給予依普利酮100 mg/(kg·d)、替米沙坦10 mg/(kg· d)、替米沙坦10 mg/(kg·d)+依普利酮100 mg/ (kg·d)、生理鹽水1 mL/d。用藥共8周。

1.2 主要試劑和儀器 依普利酮、替米沙坦等原料藥購(gòu)自武漢富馳生物科技有限公司。兔抗大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)抗體購(gòu)自北京博奧森公司，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)蛋白2(Smad2)抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)量 給藥前、給藥2周及7周應(yīng)用尾套法測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓［3］。連續(xù)測(cè)3次，取平均值。

1.3.2 左心室質(zhì)量指數(shù)、截面直徑測(cè)量 給藥8周，所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛2 mL/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定四肢，沿腹正中切開(kāi)皮膚，暴露腹主動(dòng)脈，以分叉處向心端1～3 mm處為穿刺點(diǎn)，采血8～10 mL，處死大鼠。取大體心臟標(biāo)本，測(cè)量左心室質(zhì)量指數(shù)［3］。測(cè)量完心臟質(zhì)量后，迅速將心臟置于4%多聚甲醛中固定心肌組織，固定1周后，于長(zhǎng)軸中點(diǎn)垂直橫切心臟，直接法測(cè)量左心室截面直徑，即分別測(cè)定最短徑(DAMIN)和最長(zhǎng)徑(DMAN)，取其幾何平均值。

1.3.3 心肌組織HE染色 心室標(biāo)本以4%甲醛緩沖液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋，制成石蠟標(biāo)本。石蠟標(biāo)本切片后進(jìn)行脫蠟，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3.4 心肌組織BMP-7、Smad2蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)方法，BMP-7和Smad2蛋白為定位于胞質(zhì)中的棕黃色顆粒，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比［4］。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以s表示，組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組尾動(dòng)脈收縮壓比較 見(jiàn)表1。

表1 各組尾動(dòng)脈收縮壓比較(mmHg，s)

表1 各組尾動(dòng)脈收縮壓比較(mmHg，s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 n 給藥前 給藥2周 給藥7周依普利酮組 7 176.00±9.23 168.00±12.02 157.00±16.21*替米沙坦組 7 172.00±13.25 169.00±11.63 158.00±11.45*聯(lián)合組 7 174.00±9.76 170.00±13.71 172.00±23.27*對(duì)照組7 174.00±12.15 178.00±21.04 191.00±16.57

2.2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較見(jiàn)表2。

表2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較(s)

表2 各組左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室截面直徑比較(s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與聯(lián)合組比較，△P＜0.05。

組別 n左心室質(zhì)量指數(shù)(×10－3)左心室截面直徑(mm)依普利酮組 7 2.24±0.21＊△10.28±0.54替米沙坦組7 2.79±0.12 11.48±0.35聯(lián)合組 7 2.37±0.15* 10.69±0.43對(duì)照組7 2.81±0.33 12.23±0.61

2.3 各組HE染色結(jié)果 HE染色光鏡下可見(jiàn)SHR大鼠心肌細(xì)胞為長(zhǎng)桿狀，結(jié)構(gòu)單一，細(xì)胞質(zhì)含量多，細(xì)胞核染色深;心肌細(xì)胞間有少量纖維組織。依普利酮組及聯(lián)合組SHR大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、連接緊密，胞膜完整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);對(duì)照組及替米沙坦組SHR大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞間質(zhì)纖維化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 心肌組織BMP-7和Smad2免疫組化結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 各組心肌組織BMP-7和Smad2陽(yáng)性染色細(xì)胞比較(%)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，MF過(guò)程有被阻止或逆轉(zhuǎn)的可能［5，6］，心室間充質(zhì)細(xì)胞作為心室瓣膜及室間隔最初存在的形式，都來(lái)自于上皮細(xì)胞衍生［7］。BMP-7是TGF-β1家族成員之一，能夠?qū)筎GF-β1作用。TGF-β1信號(hào)會(huì)被跨膜絲氨酸，蘇氨酸激酶Ⅰ型受體、Ⅱ型受體和細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。Smad2、Smad3蛋白通過(guò)絲氨酸殘基磷酸化，與Smad4蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，在核內(nèi)控制TGF-β1反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1與BMP具有非常相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，同樣可以經(jīng)過(guò)激活細(xì)胞膜表面相應(yīng)Ⅰ型、Ⅱ型受體，形成復(fù)合體，從而激活細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白，轉(zhuǎn)入核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)的基因表達(dá)［6］。因此，BMP-7可能逆轉(zhuǎn)MF［7］，同時(shí)也可抑制心肌肥厚過(guò)程［8］。BMP激活Ⅱ型受體后，Ⅱ型受體可轉(zhuǎn)磷酸化Ⅰ型受體，進(jìn)而激活下游Smads蛋白［9］。BMP家族通過(guò)Smad1對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并且在心肌細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BMP2可通過(guò)Smad1進(jìn)一步激活3-磷酸激酶，從而增強(qiáng)心肌收縮力［10］。BMP/ Smads參與心肌細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不同亞型在MF和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮不同的作用［11，12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，依普利酮組、替米沙坦及聯(lián)合組SHR大鼠心室的相對(duì)質(zhì)量明顯低于對(duì)照組，提示依普利酮、替米沙坦及二者聯(lián)合應(yīng)用均可減緩SHR大鼠心室重構(gòu)，抑制MF。本研究中依普利酮組心肌組織Smad2陽(yáng)性表達(dá)低于對(duì)照組，依普利酮組及聯(lián)合組BMP-7陽(yáng)性表達(dá)高于對(duì)照組。由此推測(cè)，依普利酮抑制SHR大鼠MF，促進(jìn)BMP-7表達(dá)、抑制Smad2表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

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