王 昶，陳麗艷，孫曉雪，張樹明，魏文峰，王偉明（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036）

對(duì)葉百部為百部科植物對(duì)葉百部Stemona tuberosa的干燥塊根，具有潤(rùn)肺、下氣、止咳、殺蟲的功效[1]，主要分布在我國(guó)南部各省。根據(jù)文獻(xiàn)檢索[2-3]，其研究多集中于生物堿類成分，對(duì)其中的多糖類成分研究較少?，F(xiàn)代研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病原微生物、抗病毒等諸多藥理活性[4-5]，故對(duì)百部中多糖的研究也逐漸引起重視。筆者在本文中以對(duì)葉百部為研究對(duì)象，比較不同提取方法下粗多糖的提取率，并對(duì)提取效果較優(yōu)的堿水超聲波法進(jìn)行了單因素工藝參數(shù)優(yōu)化及正交試驗(yàn)研究，以期可為百部多糖的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BP211D型分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CTXNW-10B型超聲循環(huán)提取機(jī)（北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；XH-100A型微波提取器（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

對(duì)葉百部（產(chǎn)地廣西，采集時(shí)間為2012年8月，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為真品）；葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205，純度：99.5%）；試驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取對(duì)葉百部藥材30 g，加水900 ml，煎煮90 min，濾過，濾液經(jīng)Sevage法除蛋白3次后作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱定葡萄糖對(duì)照品30 mg，置于50 ml量瓶中，加適量蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖含量[6-7]

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，加水定容。精密量取此溶液0.5 ml，加4 ml濃硫酸，搖勻，5 min后加2 mg/ml蒽酮溶液1 ml，搖勻，置于100 ℃水浴加熱10 min，取出，速冷至室溫后，以水為空白試劑，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定各質(zhì)量濃度溶液的吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝11.923x－0.079 8（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.024 0～0.120 0 mg/ml。

2.2.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗(yàn) 根據(jù)相關(guān)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，精密度試驗(yàn)吸光度的RSD為1.12%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中24 h內(nèi)吸光度的RSD為2.65%（n＝7）；重復(fù)性試驗(yàn)中葡萄糖含量的RSD為3.12%（n＝6）；加樣回收率試驗(yàn)中平均回收率為97.3%（RSD＝3.62%，n＝6）。上述結(jié)果表明，葡萄糖含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.3 不同提取方法下溶劑提取百部粗多糖的比較研究

分別取對(duì)葉百部粗粉200 g，精密稱定，按表2中的方法進(jìn)行平行操作3次，取提取液測(cè)定多糖含量，計(jì)算粗多糖提取率（粗多糖含量×溶液體積/藥材量×100%），結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法下溶劑粗多糖提取率比較（n＝3）Tab 1 Comparison of the extraction rates of crude polysaccharide by different extraction methods and solvents（n＝3）

從表1可知，不同提取方法下百部粗多糖的提取率差異較大，其中以純水作溶劑時(shí)煎煮法提取率最高，超聲波法提取率較低；以堿水作溶劑時(shí)超聲波法提取率最高，而煎煮法提取率大幅降低。這表明堿性環(huán)境下，加熱會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，而在相對(duì)低溫下，加入堿液可有效提高百部粗多糖提取率。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況分析，堿水超聲波提取法具有低溫提取、操作方便、能源消耗少等優(yōu)勢(shì)，在提取率相近的情況下，生產(chǎn)效率更高，有較好的應(yīng)用推廣價(jià)值，故本試驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)堿水超聲波法提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)考察。

2.4 堿水超聲波法提取百部粗多糖工藝單因素試驗(yàn)

2.4.1 加水量對(duì)粗多糖提取率的影響 取對(duì)葉百部粗粉200 g，分別加0.3 mol/L的NaOH水溶液2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 ml，超聲處理60 min，溫度50 ℃，功率1 500 W，濾過，測(cè)定含量。結(jié)果，隨著加水量的增加，粗多糖提取率隨之增加，當(dāng)加水量為生藥質(zhì)量的30倍（6 000 ml）時(shí)，粗多糖提取率為24.91%，至40倍量時(shí)提取率為25.22%，50倍量時(shí)提取率為25.42%。結(jié)果表明加水量為30倍時(shí)，再增加水量提取率增加不明顯，故確定最優(yōu)加水量為生藥質(zhì)量的30倍。

2.4.2 溶劑濃度對(duì)粗多糖提取率的影響 取對(duì)葉百部粗粉200 g，分別加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaOH水溶液6 000 ml，超聲處理60 min，溫度50 ℃，功率1 500 W，濾過，測(cè)定。結(jié)果，隨著NaOH水溶液濃度的升高，粗多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)NaOH溶液濃度為0.3 mol/L時(shí)，粗多糖提取率達(dá)到最大值25.26%；其后，再升高NaOH溶液濃度，粗多糖提取率開始下降，當(dāng)NaOH溶液濃度為0.4 mol/L時(shí)，粗多糖提取率為22.92%，0.5 mol/L時(shí)粗多糖提取率為21.70%。結(jié)果表明多糖成分在較高濃度條件下，出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致粗多糖提取率下降，故確定最優(yōu)NaOH溶液濃度為0.3 mol/L。

2.4.3 溫度對(duì)粗多糖提取率的影響 取對(duì)葉百部粗粉200 g，加0.3 mol/L的NaOH水溶液6 000 ml，超聲處理60 min，功率1 500 W，溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，濾過，測(cè)定。結(jié)果，隨著溫度的升高，粗多糖提取率隨之增加，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，粗多糖提取率達(dá)到最大值25.46%；而后，隨著溫度升高，粗多糖提取率開始下降，60 ℃時(shí)為23.56%，70 ℃時(shí)為21.78%。結(jié)果表明溫度升高后多糖結(jié)構(gòu)開始被破壞，提取率下降，故確定最優(yōu)提取溫度為50 ℃。

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)粗多糖提取率的影響 取對(duì)葉百部粗粉200 g，加0.3 mol/L的NaOH水溶液6 000 ml，分別超聲提取30、60、90、120、150 min，溫度50 ℃，功率1 500 W，濾過，測(cè)定。結(jié)果，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)葉百部粗多糖提取率呈現(xiàn)先高后低的趨勢(shì)，提取時(shí)間在30～90 min時(shí)，粗多糖提取率呈上升趨勢(shì)，60 min時(shí)提取率為25.12%，90 min時(shí)提取率為25.23%；而后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖提取率開始下降，在120 min時(shí)提取率為23.02%，150 min時(shí)提取率為21.03%。結(jié)果表明在堿性環(huán)境下，由于長(zhǎng)時(shí)間的提取，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞而導(dǎo)致提取率下降。從數(shù)據(jù)趨勢(shì)分析，粗多糖提取率達(dá)到最大值的提取時(shí)間應(yīng)在60～90 min，故綜合提取率及效率考慮，確定最優(yōu)提取時(shí)間為70 min。

2.5 堿水超聲波法提取百部粗多糖工藝正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)所確定的工藝參數(shù)下，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，水平設(shè)計(jì)以單因素試驗(yàn)所確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為基準(zhǔn)。因素與水平見表2；正交試驗(yàn)安排與結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 3 Arrangement and results of orthogonal test

結(jié)果表明，各因素對(duì)粗多糖提取率影響程度大小依次為加水量（A）、溶劑濃度（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D），確定最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C2D2，即加水量為30倍，NaOH水溶液濃度為0.3 mol/L，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為70 min。此結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

2.6 堿水超聲波法提取百部粗多糖工藝驗(yàn)證

取對(duì)葉百部粗粉共6份，每份200 g，按上述最優(yōu)工藝進(jìn)行粗多糖提取，即加0.3 mol/L的NaOH水溶液6 000 ml，超聲提取70 min，溫度50 ℃，功率1 500 W。提取濾過后測(cè)定并計(jì)算粗多糖提取率，結(jié)果分別為26.41%、25.28%、24.31%、26.82%、25.55%、26.18%，平均值為25.76%（RSD＝3.51%，n＝6）。這表明優(yōu)選的方法可較好地提取對(duì)葉百部中的粗多糖成分。

3 討論

近年來，國(guó)際上對(duì)糖及糖復(fù)合物的研究較多，大量實(shí)驗(yàn)[4]揭示，糖類是一種重要的信息分子，參與多種生理和病理過程。到目前為止，已有300余種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要[4-5]。而對(duì)百部的研究目前多集中于生物堿類成分上[2-3]。近年來，部分研究人員在對(duì)百部中的芪類化合物、多氫菲類化合物等非堿性成分的研究上也取得了可喜的進(jìn)展[8]，但對(duì)于百部多糖的研究尚屬起步階段。有研究表明，以多糖為主的百部流浸膏對(duì)多種免疫功能具有促進(jìn)作用[9]，同時(shí)在抗氧化作用方面，百部多糖也發(fā)揮出較好的活性[10]，表明百部多糖也是百部中重要的活性物質(zhì)。百部最早收載于《名醫(yī)別錄》[11]，其中記載了其重要的潤(rùn)肺功效，但目前并未對(duì)此給予系統(tǒng)的藥理學(xué)上的闡釋，而在部分常用潤(rùn)肺中藥及食物中，如黑木耳、銀耳、蟲草、麥冬等，多糖均為其主要活性成分，故多糖作為百部中含量較高的有效成分，是否在潤(rùn)肺中發(fā)揮了一定作用值得進(jìn)一步研究。

多糖的提取方法較多，但如何在提高多糖提取效率的同時(shí)，有效保護(hù)多糖免遭破壞一直是探究的方向。本試驗(yàn)采用低溫堿水超聲波法對(duì)對(duì)葉百部粗多糖進(jìn)行提取，通過優(yōu)化工藝參數(shù)，有效提高了百部粗多糖的提取率及生產(chǎn)效率。試驗(yàn)中為避免長(zhǎng)時(shí)間超聲后水溫升高致使試驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差增加的問題，采用事先將一部分溶劑約200～500 ml放置于冰箱中低溫冷藏備用，當(dāng)提取溫度超過設(shè)定值時(shí)將其加入以控制溫度的方法。由于這部分溶劑比例較小，最終又加入到提取液中，所以對(duì)提取后數(shù)據(jù)影響較小。同時(shí)，考慮到多糖在堿液中可能會(huì)發(fā)生水解，故筆者曾采用半透膜法進(jìn)行了本法與傳統(tǒng)水提法的比較，結(jié)果表明多糖的含量變化并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在較低溫度下，百部多糖結(jié)構(gòu)得到了較好的保護(hù)，在堿液中并未發(fā)生水解現(xiàn)象。

在實(shí)際生產(chǎn)中，煎煮法提取一般采用提取罐，用蒸汽加熱，故能源消耗較大；同時(shí)生產(chǎn)工藝受鍋爐蒸汽產(chǎn)出量的影響，從而制約了其生產(chǎn)工序。而超聲波提取能源消耗低、工藝獨(dú)立性好、其他因素干擾小，在提取率接近的情況下，其生產(chǎn)效率優(yōu)勢(shì)較明顯。當(dāng)今中藥提取技術(shù)發(fā)展較快，隨著大型超聲波設(shè)備在提取中的應(yīng)用，此方法在大工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)逐漸發(fā)揮出優(yōu)勢(shì)，故具有較好的推廣價(jià)值。

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