梁婷婷　馬燕　臧德奎

摘要：采用正交直觀分析法和新復(fù)極差法對(duì)影響梨屬野生種質(zhì)資源SRAP-PCR反應(yīng)的5種因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶、模板DNA）4個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化篩選。結(jié)果表明，優(yōu)化后的梨屬SRAP-PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.4 μmol/L引物，1.5 U Taq酶，60 ng模板DNA。

關(guān)鍵詞：梨屬；SRAP-PCR；正交直觀分析法；新復(fù)極差法

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）12-0007-04

目前相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）技術(shù)已在多種果樹(shù)、蔬菜以及大田作物中得以使用，并以其多態(tài)性豐富、簡(jiǎn)單、易測(cè)序[1]等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于遺傳多樣性分析[2]、遺傳圖譜構(gòu)建[3]、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定以及比較基因組學(xué)等諸多研究領(lǐng)域。

正交PCR試驗(yàn)是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，研究各影響因素不同水平間交互作用的一種方法[4]，具有均衡分散和整齊可比的特點(diǎn)，可以簡(jiǎn)便、快速地找到反應(yīng)體系的最佳組合[5]。正交直觀分析法正是基于PCR正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的一種結(jié)果判斷方法，即根據(jù)擴(kuò)增條帶的明亮度、特異性及數(shù)量的多少進(jìn)行不同的分?jǐn)?shù)判斷，分?jǐn)?shù)越高則表明擴(kuò)增效果越好。新復(fù)極差法（SSR）是方差分析的進(jìn)一步分析，用于多種因素對(duì)某一結(jié)果影響的各個(gè)因素之間的顯著性分析。

目前基于正交設(shè)計(jì)法的SRAP-PCR技術(shù)已在辣椒、石榴等物種的相關(guān)研究中得以應(yīng)用[6，7]。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)梨屬野生種質(zhì)資源SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)正交直觀分析法和新復(fù)極差法，更直觀快速地找到梨屬SRAP-PCR反應(yīng)體系的最佳組合，以期為梨屬野生種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用與保護(hù)提供基礎(chǔ)技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為秋子梨（Pyrus ussuriensis）、褐梨（Pyrus phaeocarpa）、河北梨（Pyrus hopeiensis）、杜梨（Pyrus betulaefolia）、嶗山梨（Pyrus trilocularis）。4月中旬于山東嶗山、蒙山等地采集用于提取DNA的幼葉樣品，幼葉采集后硅膠干燥保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試劑和儀器DNA擴(kuò)增采用Bio-Rad PCR儀，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在北京六一WD-9403CS型紫外儀上采集圖像。試驗(yàn)所用引物由TaKaRa合成；用于PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2.2樣品基因組DNA的提取梨屬樣品基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[8]。基因組DNA質(zhì)量的檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳法和核酸蛋白分析儀。

1.2.3PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)試驗(yàn)采用L16（45）正交表設(shè)計(jì)，對(duì)影響擴(kuò)增結(jié)果的5因素進(jìn)行4水平共16個(gè)組合的篩選，各體系模板均為秋子梨樣品，所選引物為隨機(jī)Me5/Em11（序列見(jiàn)表3）組合，PCR反應(yīng)體系總體積設(shè)為25 μL，每組合按其濃度計(jì)算加樣量，并包含10×PCR buffer 2.5 μL，不足部分用超純水補(bǔ)足。試驗(yàn)各因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)5次；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，20 μL上樣，電壓120 V電泳90 min，電泳緩沖液為1×TAE，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后，在紫外儀上采集圖像。

PCR擴(kuò)增結(jié)果分析參照何正文等[9]的直觀分析法，即對(duì)各組合擴(kuò)增出來(lái)的條帶分別進(jìn)行分?jǐn)?shù)判定，分?jǐn)?shù)等級(jí)設(shè)為3、2、1、0分。判定評(píng)分后再參照王軍[7]、劉萌芽[11]等的方法，運(yùn)用新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4體系穩(wěn)定性檢測(cè)隨機(jī)選用6對(duì)引物組合對(duì)褐梨、杜梨、河北梨、嶗山梨 4個(gè)野生種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳觀察結(jié)果。所用引物序列見(jiàn)表3。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA電泳檢測(cè)

由圖1可知，梨屬樣品基因組DNA電泳檢測(cè)

結(jié)果良好，條帶清晰明亮。核酸蛋白分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示，A260/A280值皆在1.80至2.00之間，說(shuō)明該梨屬樣品基因組DNA提取純度和濃度都較高，符合PCR試驗(yàn)的要求。

2.2SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)中正交體系的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。通過(guò)新復(fù)極差法[10]對(duì)圖2中的16個(gè)組合（各2次重復(fù)）的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，最終得到各因素不同濃度水平的總分值、平均分值和極差值，極差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.1Mg2+濃度優(yōu)化分析Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度一般在0.5～2.5 mmol/L之間。本試驗(yàn)中，Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)，平均分值最低為8.75分；為2.0 mmol/L時(shí)，平均分值最高為12.25分。說(shuō)明梨屬SRAP-PCR反應(yīng)中Mg2+的適宜濃度為2.0 mmol/L。

2.2.2dNTPs濃度優(yōu)化分析由表4可以看出，dNTPs濃度為100 μmol/L時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)量低，平均分值也低至7.50分；濃度為200 μmol/L時(shí)，平均分值達(dá)最高值12.25分。說(shuō)明梨屬SRAP-PCR反應(yīng)的適宜dNTPs濃度為200 μmol/L。

2.2.3引物濃度優(yōu)化分析引物濃度為0.1 μmol/L時(shí)，產(chǎn)量及平均分值都最低，為8.25分；隨引物濃度增加至0.4 μmol/L時(shí)，平均分值達(dá)最高12.75分。說(shuō)明梨屬SRAP-PCR反應(yīng)的引物適宜濃度為0.4 μmol/L。

2.2.4Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)化分析Taq DNA聚合酶為2.0 U時(shí)，平均分值最低，7.50分；為1.5 U時(shí)，平均分值最高，11.75；說(shuō)明1.5 U Taq DNA聚合酶濃度為梨屬SRAP-PCR反應(yīng)的適宜濃度。

2.2.5模板用量?jī)?yōu)化分析模板DNA用量為80 ng時(shí)，平均分值最低為8.60分，可能影響PCR反應(yīng)的特異性；當(dāng)模板DNA用量下降到60 ng時(shí)，平均得分增至最高值12.50分。說(shuō)明梨屬SRAP-PCR反應(yīng)的模板適宜用量為60 ng。

綜上分析后得到的最佳反應(yīng)組合為Mg2+濃度為2.0 mmol/L，dNTPs濃度為200 μmol/L，引物濃度為0.4 μmol/L，Taq聚合酶為1.5 U，模板DNA用量為60 ng。此組合即為體系中第10個(gè)處理，由圖2可知，該組合擴(kuò)增結(jié)果清晰，條帶明亮、無(wú)重疊，適于進(jìn)行SRAP-PCR試驗(yàn)。

參照劉萌芽等[11]的方法，分析了本試驗(yàn)中各因素對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)的影響程度。由表4可知，dNTPs濃度的極差值最大，平均分高達(dá)4.75，表明dNTPs對(duì)梨屬SRAP-PCR反應(yīng)的影響最為顯著；次之為引物濃度；影響程度居中的因素為T(mén)aq DNA聚合酶；Mg2+濃度和模板DNA的影響程度最小。

2.3最優(yōu)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)

采用優(yōu)化篩選后的SRAP-PCR反應(yīng)體系結(jié)合隨機(jī)抽取的6對(duì)引物組合（Me1/Em16， Me1/Em18， Me2/Em10， Me5/Em10， Me6/Em10， Me6/Em13）對(duì)褐梨、杜梨、河北梨、嶗山梨 4個(gè)野生種進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，除第四對(duì)引物外，4個(gè)梨品種基因組均能擴(kuò)增出數(shù)量不等的條帶（圖3），表明該最優(yōu)體系可滿(mǎn)足相關(guān)試驗(yàn)的要求，有望為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ)。

3結(jié)論與討論

目前在梨屬SRAP的相關(guān)研究中，張妤艷等[12]對(duì)其影響因素進(jìn)行過(guò)篩選，但缺乏對(duì)模板DNA濃度的分析；僅董星光等[1]利用正交優(yōu)化試驗(yàn)研究過(guò)梨SRAP-PCR反應(yīng)的最適體系。由于PCR擴(kuò)增的各種不確定性，體系中任何一項(xiàng)細(xì)微差異都可能直接影響試驗(yàn)結(jié)果，所以隨著野生種質(zhì)資源關(guān)注度的提高，有必要對(duì)梨屬野生種質(zhì)資源SRAP-PCR體系再優(yōu)化，以確保資源開(kāi)發(fā)研究的順利進(jìn)行。

本研究采用正交直觀分析法和新復(fù)極差法對(duì)梨屬野生種質(zhì)資源SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。最終得出反應(yīng)的最優(yōu)組合為：25 μL的總反應(yīng)體系中含10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物 0.4 μmol/L，Taq 酶1.5 U，模板DNA 60 ng。利用該體系結(jié)合隨機(jī)抽取的6對(duì)引物組合對(duì)4份野生梨屬材料進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。因此本研究獲得的梨屬野生種質(zhì)資源SRAP-PCR優(yōu)化體系，可以為今后梨屬野生資源的進(jìn)一步研究提供一定的應(yīng)用基礎(chǔ)。

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