王紹志,張熙潔,付連浩,劉曉紅(唐山市工人醫(yī)院,河北唐山 063000)
益心舒膠囊是由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂等七味中藥組成的復(fù)方制劑,該制劑組方以生脈飲方為基礎(chǔ),增加了黃芪、丹參、川芎、山楂四味藥,提高了益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效,增加了活血化瘀的作用。因此,藥理作用較生脈飲方更勝一籌,是目前治療缺血性心血管疾病、心律失常及抗休克的中成藥。該藥已收錄于2010年版《中國藥典》(一部)成方制劑部分[1],目前其質(zhì)控定量標(biāo)準(zhǔn)已有采用高效液相色譜(HPLC)法測定1~3種成分[2-8],以及對益心舒片的脂溶性成分測定[9-10]的報道。為更好地控制本制劑內(nèi)在質(zhì)量,筆者參考了相關(guān)文獻[11-12],采用雙波長HPLC-二極管陣列檢測(DAD)法,建立了測定益心舒膠囊中4 種水溶性有效成分(丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B)的定量分析方法,并對3 個批次藥品進行含量測定。
1200 系列HPLC 儀,包括G1315D DAD 器、G1311A 四元泵、G1329A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G1322A 脫氣機、化學(xué)工作站B.03.02版(美國Agilent公司);細胞型1810D摩爾純水機(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司);CP225D 型電子天平(德國Sartorius 公司);80-2 型離心沉淀機(上海手術(shù)器械廠);FS-150N型超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司)。
益心舒膠囊(貴州信邦制藥股份有限公司,批號:20120211、20121110、20121209,規(guī)格:0.4 g×36 粒/盒);丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B對照品(均購于中國食品藥品檢定研究院,批號分別為110855-200507、110810-200205、0773-9910、111562-201212,純度均為100%);甲醇、乙腈均為色譜純,甲酸、冰醋酸、磷酸均為分析純,水為超純水(摩爾純水機自制)。
色譜柱:Eclipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm,5μm);流動相:0.5%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)-乙腈(C),梯度洗脫(洗脫程序詳見表1);流速:1.0 ml/min;檢測波長:280 nm(丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B)、320 nm(阿魏酸);柱溫:30 ℃;進樣量:10 μl。
表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B對照品適量,置于同一10 ml量瓶中,用75%甲醇溶解定容,經(jīng)0.45 μm 有機膜濾過,即得含各成分質(zhì)量濃度分別為0.212、0.35、0.2、3 mg/ml的混合對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液 取益心舒膠囊約0.3 g,精密稱定,置于10 ml 量瓶中,加75%甲醇稀釋至刻度,超聲(功率:80 W,頻率:20 kHz)處理30 min 后,冷卻,再用75%甲醇補足減失的質(zhì)量,以半徑為5 cm、3 500 r/min 離心10 min,吸取上清液,經(jīng)0.45 μm有機膜濾過,即得供試品溶液。
2.2.3 陰性對照溶液 按益心舒膠囊組方工藝分別制成不含丹參、川芎的兩種陰性對照制劑,再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液,即得。
分別取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜,詳見圖1。由圖1可見,丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B峰形良好,保留時間分別在8、12、31、40 min 左右,理論板數(shù)均大于10 000,與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5。對陰性對照溶液進樣分析,將所得色譜圖與供試品圖進行比較,發(fā)現(xiàn)陰性對照溶液對所測組分的測定無干擾。
精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,用75%甲醇溶液倍比稀釋成系列混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(x,μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸,回歸方程和線性范圍詳見表2。
取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,逐倍稀釋,精密吸取10 μl,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,以信噪比為3計算丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 的最低檢測限分別為1.06、0.10、0.03、150 ng/ml。
取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6 次,記錄峰面積。結(jié)果,丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為0.74%、1.70%、0.85%、1.50%(n=6),表明儀器精密度良好。
取供試品溶液(批號:20120211)適量,分別于放置1、2、4、8、10、12 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為0.97%、0.89%、1.30%、1.60%(n=6),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品;B.供試品;C.缺丹參的陰性對照品;D.缺川芎的陰性對照品;1.丹參素;2.原兒茶醛;3.阿魏酸;4.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance;B.test sample;C.negative sample without Salvia miltiorrhiza;D.negative sample without Ligusticum chuanxiong;1.tanshinol;2.protocatechuic aldehyde;3.ferulic acid;4.salvianolic acid B
表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges
取同一批樣品(批號:20120211)6 份,每份約0.3 g,精密稱定,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為1.10%、1.30%、0.82%、1.90%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。
取已知含量的益心舒膠囊(批號:20120211)9 份,每份約0.15 g,精密稱定,平行分組,每組3份,分別按相當(dāng)于樣品中各組分含量的80%、100%、120%的量加入混合對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率,結(jié)果見表3。
表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab 3 Results of recovery tests(n=9)
取3 批樣品各約0.3 g,精密稱定,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算樣品含量,結(jié)果見表4。
表4 樣品含量測定結(jié)果(,n=3)Tab 4 Results of content determination of samples(,n=3)
表4 樣品含量測定結(jié)果(,n=3)Tab 4 Results of content determination of samples(,n=3)
在提取條件的選擇上,分別對不同提取溶劑及超聲時間進行了比較,分別以水、甲醇、乙腈、甲酸、冰醋酸、磷酸進行,最終發(fā)現(xiàn)以75%甲醇萃取,超聲處理30 min 時,各組分分離度較好。
選取0.5%磷酸水溶液-甲醇-乙腈為流動相進行梯度洗脫,不僅可以得到滿意峰形以及相對較大的峰面積,而且分離效果與靈敏度均較好。
DAD 可以同時選擇多個波長進行檢測。本文選擇丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B 在280 nm,阿魏酸在320 nm 波長處進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各主要成分在各自的最大吸收波長下均可得到較好分離。
綜上所述,該方法簡單易行、重復(fù)性好,可用于益心舒膠囊的質(zhì)量控制。
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