陳洪宇，韓　威，姜　恒，尹曉琳，李　輝，李玉麒，伍成淑　(.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗輸血方向本科班，四川 成都 60500；.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院臨床輸血教研室，四川 成都 60500)

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Tween遮蔽RBC表面抗原制備通用血型的初步研究

陳洪宇1，韓威2，姜恒2，尹曉琳1，李輝1，李玉麒1，伍成淑1(1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗輸血方向本科班，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院臨床輸血教研室，四川 成都 610500)

[摘要]目的探討Tween對紅細胞表面抗原(主要是ABO和D抗原)的遮蔽效果以及紅細胞的穩(wěn)定性。方法采用不同濃度的Tween孵育不同血型紅細胞，并對其孵育前后抗原效價進行比較，以及采用形態(tài)觀察，滲透脆性、自身溶血率、氧飽和度(SO2)、RBC平均指數(shù)檢測和上清液游離血紅蛋白測定判斷孵育后紅細胞的基本功能變化，以證實其穩(wěn)定情況。結(jié)果Tween-20對D抗原的孵育效果較好且穩(wěn)定，減弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不穩(wěn)定，A抗原的遮蔽效果較弱，優(yōu)勢濃度在0.004%附近。Tween-80對D、B遮蔽效果差異并不明顯，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果較好，保持在“+”以上。結(jié)論Tween-20，Tween-80可以遮蔽RBC表面抗原，并使其減弱程度保持在“+”以上，RBC形態(tài)及功能沒有發(fā)生變化。

[關(guān)鍵詞]紅細胞表面抗原；Tween-20;Tween-80；化學(xué)修飾；通用血型

輸血治療的原則是供受者血型相同或相容。在當(dāng)今社會，器官移植已逐漸成為一種常見的治療方式，而輸注紅細胞是其中最常見也是耐受性最好的一種移植手段。血型系統(tǒng)尤其是ABO和Rh血型系統(tǒng)在輸血中具有重要的作用，ABO血型不合引起輸血反應(yīng)的概率是100%，而RhD不合也有50%的可能。一般情況下，要求輸入相同型血，但在緊急情況下，例如稀有血型、重大自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭等，由于不能保證同型血的及時供應(yīng)，一般要求以交叉配血相容為前提的異型輸血，一般以O(shè)型血作為供血者。對此，希望能通過生物技術(shù)將A、B和AB型紅細胞轉(zhuǎn)化成通用的O型紅細胞，使用大分子化學(xué)材料對細胞抗原進行遮蔽，避免機體免疫系統(tǒng)的攻擊，使供體組織器官能更好地在受者體內(nèi)生存是一種比較簡單可行的方法。

美國研究員Scott利用化學(xué)材料：甲氧基聚乙二醇(methoxy polyethylene glycol，mPEG)修飾紅細胞發(fā)現(xiàn)以共價鍵結(jié)合在RBC膜上的mPEG可以阻斷抗-A、抗-B對A、B抗原的凝集反應(yīng)。但是，后又有試驗證明mPEG并不能完全遮蔽抗原，并不能達到臨床輸血前配血標(biāo)準(zhǔn)，并有考慮到PEG抗體存在的可能性[1-4]。本實驗室期望能找到另一種化學(xué)材料能夠起到更好的抗原遮蔽作用。聚山梨醇酯(Tween,Polysorbate，吐溫)，與PEG有類似理化性質(zhì)，是一種非離子型表面活性劑，為淡黃色至橙黃色的黏稠液體，其結(jié)構(gòu)中既有親水基團，又有親油基團。現(xiàn)將A、B、O 3種紅細胞采用Tween-20、Tween-80進行化學(xué)修飾，并觀察其修飾紅細胞A、B和D抗原的遮蔽效果，作出初步研究。

1材料與方法

1.1研究對象

收集合格的健康獻血者A、B、O三種血型紅細胞(枸櫞酸鹽抗凝)。

1.2主要試劑和儀器

Tween-20(購自美國Sigma公司，批號P1379，規(guī)格25 mL);Tween-80(購自美國Sigma公司，批號P1754，規(guī)格25 mL);抗-A、抗-B血型定型試劑(單克隆試劑；購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號20110820);RhD(IgM)血型定型試劑(單克隆抗體；購自上海生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號20110218);0.9%氯化鈉注射液(購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號M11072715);自配pH 7.0～7.5等滲磷酸鹽緩沖液[4]。血型血清學(xué)專用離心機(KUBOTA HA-2200，日本);721分光光度計(T6新世紀(jì)，北京譜析儀器有限責(zé)任公司);電子天平(MP2002，上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司)；優(yōu)普純水機(購自成都超純科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1Tween孵育紅細胞用生理鹽水洗滌紅細胞3次(2 500 r/min，1 min離心，棄上清)。將制備好的新鮮紅細胞壓積加至自制PBS配制的孵育液，使終濃度為Tween-20:0.40‰,0.44‰,0.52‰;Tween-80:0.74‰,0.80‰,0.82‰。加入后輕輕混勻，A、B型置于4 ℃，O型室溫孵育2 h,期間每0.5 h混勻1次，以加強反應(yīng)。

1.3.2Tween孵育后紅細胞表面抗原效價測定2 h后取出，棄上層清液，用生理鹽水洗滌3次，方法同上。后配成2%～5%紅細胞懸液，與相應(yīng)抗血清1∶1反應(yīng)，測定抗原效價。

1.3.3Tween孵育前后紅細胞形態(tài)觀察，滲透脆性、自身溶血率和氧飽和度(SO2)檢測取被Tween孵育后和對照組RBC做推片，經(jīng)瑞士染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)的變化；取Tween孵育后與對照組的RBC懸液(50%)10 μl加入1.25 mL按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第2版配制的41.0 ～116.3 mmol/L的NaCl梯度溶液，判斷RBC的滲透脆性變化；取Tween組與實驗組的RBC置37 ℃ 48 h，離心3 min(1 000 r/min)取上層清液，以PBS等滲液為空白對照，檢測上清液在540 nm處的光吸收值，計算RBC自身溶血率，以溶血者對照管測定值作為陽性對照(正常RBC)，以PBS等滲液測定值作為陰性對照；SO2用血氣檢測試劑(由德國羅氏診斷有限公司提供)測定。

1.3.4Tween孵育前后紅細胞形態(tài)觀察，滲透脆性、自身溶血率和氧飽和度(SO2)檢測查看血細胞分析儀MCV、MCH、MCHC、RDW-SD、RDW-CV及Tween 孵育液是否是紅細胞產(chǎn)生肉眼不可見溶血，使用鄰家聯(lián)苯胺法[5]測定上清中游離血紅蛋白量。

2結(jié)果

2.1不同濃度遮蔽紅細胞上A、B和D抗原的情況

通過試管法在抗血清1∶4～1∶32的濃度下分別進行凝集反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Tween-20對D抗原的孵育效果較好且穩(wěn)定，減弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不穩(wěn)定，A抗原的遮蔽效果較弱，優(yōu)勢濃度在0.4‰附近。Tween-80對D、B遮蔽差異并不明顯，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果較好，保持“+”以上(表1)。

表1　不同濃度遮蔽紅細胞上A、B和D抗原的情況

+～4+:凝集程度逐漸增強;w:表示偏弱紅細胞功能改變情況

2.2紅細胞功能改變情況

紅細胞孵育前后形態(tài)涂片檢查無異常，紅細胞仍為正常大小的雙凹圓盤狀；滲透脆性較空白正常或略減弱，但都在P<0.05；自身溶血率較空白略高，P<0.05，其中Tween-800.74%、0.82%與空白相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2；SO2都高于97%(參考值：95%～99%)。

2.3紅細胞形態(tài)變化

HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW-SD、RDW-CV都處于正常范圍內(nèi)(表3)；孵育液(孵育后留取上清)血紅蛋白量趨于0，見表2、表3。

3討論

Tween-20及Tween-80分子中有較多的親水性基團一聚氧乙烯基，故親水性強，為一種非離子型去污劑，二者區(qū)別在于Tween的編號依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定，Tween系列產(chǎn)品常作為乳化劑廣泛用在食品，化妝品和其他行業(yè)中。Tween-80已經(jīng)在大量的經(jīng)口途徑或非消化道途徑的藥物制劑中應(yīng)用，對其安全性進行了較為深入的研究。Tween-20、Tween-80對紅細胞均有溶血作用，以Tween-80作用最弱。二者與PEG具有相似的理化性質(zhì)，國內(nèi)最近幾年

表2　紅細胞功能改變情況

*：與對照組比較，P<0.05

許多人士對PEG對紅細胞表面抗原遮蔽效果進行研究，研究結(jié)果表明PEG對紅細胞表面抗原有遮蔽的作用，為制備通用血型奠定了基礎(chǔ)[5-11]。本實驗證明了不同濃度Tween-20、Tween-80對紅細胞的遮蔽效果有明顯差異，Tween-20對D抗原的孵育效果較好且穩(wěn)定，減弱程度保持在“+”以上，B抗原遮蔽略差且并不穩(wěn)定，A抗原的遮蔽效果較弱，優(yōu)勢濃度在0.40‰附近。Tween-80對D、B遮蔽差異并不明顯，在0.74%、0.80%附近遮蔽效果較好，保持“+”以上，說明Tween-20、Tween-80也具有和PEG類似的抗原屏蔽作用，但是目前的研究機制尚未清楚，有待進一步研究。盡管化學(xué)物質(zhì)遮蔽紅細胞的抗原的研究還存在一些問題，但它為制備通用型血的研究提供了很多線索，具有很大的研究價值和應(yīng)用前景。未來，人們可望達到既完全遮蔽紅細胞的血型抗原，又不影響其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能和壽命的目的，最終實現(xiàn)制備通用型血液的目標(biāo)。

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(編輯：楊穎)

Preliminary study on preparation of universal blood type through masking RBC’s surface antigen with Tween

CHEN Hong-yu1,HAN Wei2,JIANG Heng2,YIN Xiao-lin1,LI Hui1,LI Yu-qi1,WU Cheng-shu1(1.Undergraduate Classes of Medical Transfusion Direction,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 610500,China；2.Teaching and Research Section of Blood Transfusion,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 610500,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the shielding effect that Tween has made on the erythrocyte’s surface antigen(ABO and D antigen mainly) and the stability of the RBC. MethodsVarious types red blood cells’ surface antigens were incubated with different concentrations of Tween,then the titers of RBC’s surface antigen before and after incubation were compared. The erythrocyte’s function alterations and stability through the morphological obersavation,the osmotic fragility,RBC’s own hemolysis rate,oxygen saturation(SO2),routine test of blood as well as the supernatant of free hemoglobin determination were confirmed. ResultsThe masking effect of the Tween-20 on D antigen with the weaken titer keeping above “+” was better and more stable than that on A,B antigen.The impact on B antigen was a little worse,and A was the worst.The advantaged concentration is about 0.004%.Besides,the influence of Tween-80’s on B and D antigen was not apparent enough.Among all of the concentration,0.74% and 0.80% did a relatively better job,which also could keep the weaken titer above “+”. ConclulsionThe shielding effect that Tween has made on the erythrocyte’s surface antigen(ABO and D antigen mainly) is stable,which keeps above “+”.The morphology and function of the RBC does not change.

Keywords:surface antigens on red blood cells;Tween-20;Tween-80;chemical modification;universal blood type

[收稿日期]2014-08-29[修回日期] 2014-09-17

[基金項目]成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實驗項目(CX201112)

doi:10.11659/jjssx.06E014388

[中圖分類號]R331.141;R457.1

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)01-0060-03