廖源林 蔡仕珍 鄧輝茗 龍聰穎 陳彥青 葉充 熊磊 王琰琳

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都，611130)

責(zé)任編輯:任 俐。

我國(guó)土壤重金屬污染較嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，受污染的土地已達(dá)上萬(wàn)公頃，西南地區(qū)是污染的多發(fā)區(qū)，Cd2+污染概率最高，毒性較強(qiáng)［1］。土壤中的Cd2+進(jìn)入植株體內(nèi)會(huì)使染色體黏連、斷裂或液化，核苷酸損傷，影響細(xì)胞的正常分裂，蛋白質(zhì)變性［2-4］;使葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，降低葉綠素含量，影響植物正常的光合作用［5-6］;使體內(nèi)活性氧過(guò)多的積累，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化加劇，從而抑制植物生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植株死亡。在逆境條件下，植物通過(guò)啟動(dòng)自身的防御系統(tǒng)，主動(dòng)避御逆境傷害，減輕逆境的氧化損傷，維持膜系統(tǒng)的完整性和穩(wěn)定性，增加對(duì)逆境的適應(yīng)性。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)以及抗壞血酸—谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)中抗氧化劑和相關(guān)的酶均在清除活性氧的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SOD、CAT 和POD等保護(hù)酶在低濃度Cd2+脅迫中活性升高，利于清除植株體內(nèi)過(guò)量的活性氧，維持活性氧的代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，隨Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，植物葉片POD 活性逐漸增加，CAT 活性逐漸減少，SOD 活性呈單峰曲線［8］，即3 種酶的變化趨勢(shì)不完全一致，而AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和GSH 質(zhì)量摩爾濃度幾乎都先上升后下降［9］。但在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd2+脅迫下，POD、CAT 和SOD 酶活性明顯下降［10-15］。說(shuō)明植物在耐受Cd2+的閾值內(nèi)，抗氧化酶類通過(guò)活性的變化協(xié)同作用，以避御對(duì)植株體的傷害。對(duì)AsA-GSH 循環(huán)中關(guān)鍵酶在Cd2+脅迫下的動(dòng)態(tài)變化的研究較少，對(duì)整個(gè)抗氧化系統(tǒng)的協(xié)同作用研究鮮見報(bào)道。

苦楝(Melia azedarach Linn.)，又名苦苓、金鈴子、森樹等，為楝科(Meliaceae)楝屬的落葉喬木，廣布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是西南地區(qū)常見的鄉(xiāng)土樹種，具有生長(zhǎng)快、耐瘠薄、耐煙塵、抗二氧化硫、對(duì)土壤要求不嚴(yán)等特點(diǎn)，觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值高，宜作庭蔭樹及行道樹，是工礦區(qū)綠化的優(yōu)選樹種。植株體內(nèi)的苦楝素、苦楝醇和酚酸類等化合物是有效制藥成分，葉中的類固醇和果實(shí)中的檸檬苦素類似物對(duì)癌癥細(xì)胞有一定的毒害作用［16-17］。前人研究認(rèn)為，苦楝具有一定的耐鹽性［18-19］、耐寒性［20］及耐旱性［21］。而有關(guān)重金屬對(duì)苦楝的生理影響嘗未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)重金屬Cd2+對(duì)苦楝抗氧化酶系統(tǒng)影響的研究，嘗試了解其對(duì)Cd2+的耐受機(jī)制，判斷對(duì)Cd2+的耐受能力，以期為苦楝在重金屬污染區(qū)推廣運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

2014年1月份于四川溫江7—8 齡實(shí)生樹母株上采集種子，凈種后選種粒飽滿的優(yōu)質(zhì)種子，3月上旬播種在上口徑15 cm、高15 cm 的塑料花盆中，播種基質(zhì)為V(田園土)∶V(草炭)∶V(河沙)= 5 ∶3 ∶2，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地內(nèi)保護(hù)地培養(yǎng)。

種植土Cd2+處理:將原土風(fēng)干、碾碎、剔除雜物，過(guò)孔徑5 mm 的鋼篩后，w(原土)∶w(草炭土)∶w(沙)= 5 ∶1 ∶1 混合均勻，800 倍液多菌靈消毒后靜置3 d，測(cè)定土壤的氮、磷、鉀、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.47、0.69、3.72、43.05 g·kg-1，Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8 mg·kg-1。采取盆栽試驗(yàn)方式，栽培容器為上徑×下徑×高=34 cm×21 cm×27 cm 的白色聚乙烯塑料盆，盆底放置蓄水墊盤，每盆裝土7 kg，土壤中的外源Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度以Cd2+計(jì)，分別為0、30、60、90、120、150、180 mg·kg-1，用分析純CdCl2·2.5H2O 配成溶液形式加入Cd2+，混合均勻，使土壤成黏稠狀，在室內(nèi)穩(wěn)定半月后用于試驗(yàn)。

2014年8月1 號(hào)選取生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)基本一致、株高30～40 cm 的植株，移栽至Cd2+處理土壤的盆中，Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分別為0、30、60、90、120、150、180 mg·kg-1，試驗(yàn)每盆一株，每個(gè)處理10 盆，3個(gè)重復(fù)，共210 株。移栽后第1 周保證葉片不失水，1 周后正常管理，持續(xù)脅迫2 個(gè)月，處理期間每隔3 d 澆一次400 mL 清水，如有滲出液要反復(fù)回澆，直到?jīng)]有滲出液為止。每隔20 d 取材一次，分別于20、40、60 d 09:00 開始取植物第3～5 片葉(從上到下)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

抗氧化酶活性的測(cè)定:超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法，過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［22］。

ASA-GSH 循環(huán)的測(cè)定:抗壞血酸(ASA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和谷胱甘肽(GSH)質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定參照丁繼軍［23］的方法;抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性測(cè)定參照Yoshiyuki et al.［24］的方法，單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)的活性和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的活性測(cè)定參照Stasolla et al.［25］的方法，谷胱甘肽還原酶(GR)的活性參照Oliver et al.［26］的方法。

采用Excel 07 軟件對(duì)試驗(yàn)所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步計(jì)算，SPSS19.0 程序進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)(LSD)，采用Excel 07 繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對(duì)苦楝葉片SOD、CAT、POD 活性的影響

由表1可知，隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加SOD 活性呈快速增加后逐漸降低的趨勢(shì)，CAT 活性呈迅速增加后急劇下降趨勢(shì)，POD 活性呈緩慢上升后急劇下降趨勢(shì)，三者活性均在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1處理60 d 時(shí)最低。其中20 d 和40 d 處理下，SOD、CAT 和POD 活性的峰值依次出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90、120、150 mg·kg-1處理時(shí);與CK 相比，SOD活性增幅依次為6%～24%和4%～23%，CAT 活性依次為72%～178%和163%～337%，POD 活性為67%～99%和91%～129%。60 d 處理下，SOD 和CAT 活性的峰值出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)60 mg·kg-1時(shí)，POD 活性的峰值則在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 mg·kg-1時(shí);與CK 相比，SOD、CAT 和POD 活性的增幅依次為1%～16%、126%～311%和60%～110%。

在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，SOD 和CAT 活性在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60 mg·kg-1，POD 活性則在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90 mg·kg-1時(shí)，均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，20 d 處理均顯著低于60 d 處理(p＜0.05);SOD 活性在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90、120 mg·kg-1、CAT 活性在120、150、180 mg·kg-1、POD 活性在120、150、180 mg·kg-1時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)先升后降，以40 d 的最大，顯著高于20 d 和60 d。SOD活性在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)150、180 mg·kg-1時(shí)，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，各處理時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著(p＞0.05)。表明Cd2+誘導(dǎo)激活了SOD、CAT 和POD 活性，提高了活性氧的清除能力，而激活3 種酶活性達(dá)到最大值的Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)值不一致，3 種酶均有一定閾值，超過(guò)閾值活性下降，清除活性氧能力下降。3 種酶隨處理時(shí)間延長(zhǎng)的活性變化趨勢(shì)不盡一致，活性變化幅度不同，體現(xiàn)了三者清除自由基時(shí)的協(xié)同作用機(jī)制，對(duì)提高苦楝的抗氧化能力，保護(hù)苦楝不受Cd2+傷害具有重要作用。

表1 重金屬Cd2+對(duì)苦楝葉片SOD、CAT、POD 活性的影響

2.2 Cd2+對(duì)苦楝葉片AsA-GSH 循壞系統(tǒng)的影響

2.2.1 Cd2+對(duì)苦楝葉片AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和GSH 質(zhì)量摩爾濃度的影響

AsA 是植物細(xì)胞內(nèi)非酶促防御系統(tǒng)中具有多種抗氧化功能的有效抗氧化劑，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝具有重要作用。由表2可知，隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈急劇升高后快速降低趨勢(shì)，以Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1處理60 d 最低，比CK 低35%。其中AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20、40 d 處理時(shí)的峰值均出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)，60 d處理的峰值則在質(zhì)量分?jǐn)?shù)60 mg·kg-1時(shí);與CK 相比，20、40、60 d 處理的增幅分別為56%、67%和112%，降幅分別為22%、17%和35%。3 個(gè)處理時(shí)間條件下，當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)30、60、90 mg·kg-1時(shí)，AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，60 d處理顯著高于20、40 d(p＜0.05)。當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120、150、180 mg·kg-1時(shí)，AsA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先升后降趨勢(shì)，均以40 d 最大，120 mg·kg-1時(shí)各時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著;150 mg·kg-1時(shí)40 d 顯著高于20 d;180 mg·kg-1時(shí)，40 d 顯著高于60 d(p＜0.05)。

GSH 是植物細(xì)胞中一種重要的抗氧化劑，在AsA-GSH 循壞中參與AsA 的再生，其質(zhì)量摩爾濃度對(duì)增強(qiáng)植物抗逆性具有重要作用。隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，GSH 質(zhì)量摩爾濃度呈先逐漸增加后逐漸減少的趨勢(shì)，其中處理20 d 的GSH 質(zhì)量摩爾濃度峰值在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)，較CK 增加20%，180 mg·kg-1時(shí)最低，比CK 少5%;處理40、60 d 的GSH 質(zhì)量摩爾濃度峰值在質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 mg·kg-1時(shí)，分別比CK 多37%、27%，180 mg·kg-1時(shí)，比CK 多14%、15%。當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90 mg·kg-1時(shí)，GSH 質(zhì)量摩爾濃度隨處理時(shí)間的增加而減小，20 d 處理顯著高于40、60 d 處理;Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)120、150 mg·kg-1時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)先升后降，以40 d的最大，60 d 的最低，60 d 處理顯著低于20、40 d 處理。GSH 質(zhì)量摩爾濃度增加表明其參與AsA 的再生，促進(jìn)AsA-GSH 循壞。反之，會(huì)抑制AsA-GSH循壞。

2.2.2 Cd2+對(duì)苦楝葉片APX、MDAR、DHAR、GR 活性的影響

APX 是AsA-GSH 循環(huán)中的重要酶，逆境下，AsA 在APX 作用下與H2O2，尤其是葉綠體中的H2O2反應(yīng)，使H2O2被還原成水，以清除H2O2毒性。由表2可知，隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，APX活性呈急劇升高后快速降低趨勢(shì)。處理20、40、60 d時(shí)，APX 活性峰值均出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 mg·kg-1時(shí)，最低值均出現(xiàn)在180 mg·kg-1時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)的增幅分別比CK 高31%～62%、14%～57%和33%～82%。當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90、120 mg·kg-1時(shí)，APX 活性除Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)60 mg·kg-1處理40 d時(shí)顯著高于20 d 外，其余各處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)在各時(shí)間點(diǎn)間差異均不顯著(p＞0.05);當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150～180 mg·kg-1時(shí)，60 d 處理顯著低于20 d 處理(p＜0.05)。表明APX 活性升高，促進(jìn)了活性氧的清除，尤其是Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1處理60 d 時(shí)，APX 依然具有高于CK33%的活性，對(duì)促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)和高效清除H2O2具有重要作用。

GR 是清除植物細(xì)胞內(nèi)部H2O2的酶催化系統(tǒng)，可維持細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量穩(wěn)定，催化GSSG 還原為GSH，其活性大小直接決定GSH 的水平，限制ASA-GSH 循環(huán)的運(yùn)行速率。GR 活性隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈逐漸升高后快速降低的趨勢(shì)，處理20、40、60 d 的GR 活性峰值均出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)，分別比CK 高35%、33%和39%，Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1時(shí)最低，依次比CK 降低9%、16%和15%。當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90 mg·kg-1時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)間GR 活性差異不明顯(p＞0.05)，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120、150、180 mg·kg-1時(shí)，20 d 處理顯著高于60 d 處理(p ＜0.05)。表明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd2+誘導(dǎo)了GR 活性的增加，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(180 mg·kg-1)和長(zhǎng)時(shí)間(60 d)脅迫對(duì)酶的活性產(chǎn)生了抑制作用。

MDAR 和DHAR 是AsA-GSH 循環(huán)中AsA 再生的2 個(gè)重要限速酶。處理20、40 d 時(shí)，MDAR 活性隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈逐漸升高后緩慢降低的趨勢(shì)，處理60 d 時(shí)則呈逐漸降低趨勢(shì)。其中處理20 d 的MDAR 活性峰值在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)，處理40 d 的峰值在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 mg·kg-1時(shí)，分別比CK 高28%和5%，最低值在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1時(shí)，20 d 和40 d 分別比CK 低25%和39%;Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1處理60 d時(shí)較CK 下降了39%。當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、120、150 mg·kg-1時(shí)，MDAR 活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)先增加后降低，均以40 d 的最大，20 d 的最低;當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90、180 mg·kg-1時(shí)，MDAR 活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，20 d 處理顯著高于60 d 處理(p＜0.05)。

DHAR 活性隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加均呈逐漸升高后逐漸降低趨勢(shì)，處理20、40、60 d 的DHAR 活性峰值均出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)，分別比CK 高44%、46%和51%，Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)180 mg·kg-1時(shí)最低，但仍分別比CK 高8%、4%和6%(p＞0.05)。在同一Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，DHAR 活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后降低，均以40 d 的最大，當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90、120 mg·kg-1時(shí)，以20 d最低，當(dāng)Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150、180 mg·kg-1時(shí)60 d的最低，各時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著(p＞0.05)。

表2 重金屬Cd2+對(duì)苦楝葉片ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、GSH 質(zhì)量摩爾濃度及APX、MDAR、DHAR、GR 活性的影響

從上述ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)中ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、GSH 質(zhì)量摩爾濃度及關(guān)鍵酶活性的變化情況表明，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Cd2+脅迫處理能使苦楝ASA-GSH循環(huán)中抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(質(zhì)量摩爾濃度)升高，酶活性增加，而高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Cd2+會(huì)降低抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(質(zhì)量摩爾濃度)及酶活性;ASA-GSH 循環(huán)中抗氧化劑與抗氧化酶起到協(xié)同抗氧化的作用，以減輕Cd2+脅迫帶來(lái)的傷害;ASA-GSH 是Cd2+脅迫下苦楝清除活性氧和自由基的重要途徑。

3 結(jié)論與討論

在正常條件下，植物細(xì)胞進(jìn)行代謝的過(guò)程中，有多種途徑可產(chǎn)生活性氧，如線粒體、葉綠體和質(zhì)膜上的電子傳遞至分子氧的過(guò)程均會(huì)產(chǎn)生活躍且具毒性的活性氧［27］。因植物具有抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，活性氧的產(chǎn)生與消除保持著平衡，植物不會(huì)受到氧化傷害，而在逆境脅迫條件下，植物產(chǎn)生的活性氧超出了清除系統(tǒng)的清除能力，活性氧產(chǎn)生和消除間的平衡被打破，導(dǎo)致活性氧大量積累，植物受到氧化傷害。

重金屬脅迫對(duì)植物的毒害機(jī)理之一就是導(dǎo)致過(guò)量的活性氧的產(chǎn)生與積累，當(dāng)活性氧超過(guò)正常水平時(shí)，即對(duì)植物產(chǎn)生氧化傷害。三大保護(hù)性酶SOD、CAT、POD 在逆境下對(duì)活性氧自由基的清除具有重要的作用。SOD 將脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子歧化成H2O2，CAT 和POD 將H2O2脫毒分解成H2O 和O2。前人研究表明，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度Cd2+(＜1.0 mg·L-1)使金魚藻體內(nèi)SOD、CAT 活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，而高濃度Cd2+(＞2.0 mg·L-1)使二者活性均顯著下降［28］。說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd2+誘導(dǎo)了抗氧化酶活性的升高，而高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd2+或長(zhǎng)時(shí)間的脅迫則使酶活性降低［29］，酶活性存在一個(gè)閾值，在一定Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間內(nèi)，酶活性得以提高和維持，超過(guò)這個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍，活性則下降［30］。本試驗(yàn)中，20、40 d 處理下，SOD、CAT、POD活性的峰值依次出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90、120、150 mg·kg-1處理時(shí)，60 d 處理下，SOD、CAT 活性的峰值出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)60 mg·kg-1時(shí)，POD 活性的峰值則在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí)。且SOD 活性較CAT、POD 活性提前達(dá)到峰值水平，活性的變化幅度較CAT、POD 活性的小，但保持相對(duì)較高的水平，說(shuō)明SOD 作為消除活性氧的先鋒，在使苦楝葉片免受氧化傷害中起著重要作用，三大酶活性峰值所對(duì)應(yīng)的Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，體現(xiàn)了三者在苦楝受到Cd2+脅迫時(shí)，共同協(xié)作清除脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子等活性氧，以減輕逆境帶來(lái)的氧化傷害的生理機(jī)制。20、40 d 處理下Cd2+脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于120 mg·kg-1時(shí)，以及60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60 mg·kg-1時(shí)，SOD、CAT 活性均下降，表明脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基超出了2 種酶清除的能力范圍。POD 活性峰值處理為20、40 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)150 mg·kg-1，60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1，由于POD 的雙重生理功能，一方面參與消除羥基自由基，另一方面逆境加劇及葉片衰老初期參與活性氧的生成和葉綠素的降解，并引發(fā)膜質(zhì)過(guò)氧化作用，所以其活性的提高即表明其清除H2O2能力的增強(qiáng)，也預(yù)示著植物受氧化程度的加劇及組織的老化［31-32］。因此，推測(cè)20、40 d 處理下Cd2+脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于120 mg·kg-1，以及60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60 mg·kg-1，苦楝葉片活性氧自由基的產(chǎn)生和積累超過(guò)了3 種保護(hù)性酶的清除和調(diào)節(jié)能力，植物體會(huì)產(chǎn)生氧化傷害。

ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)是清除活性氧自由基的重要途徑，可將H2O2還原成H2O 和O2，使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平降低［33］。其中，抗氧化劑ASA 可直接或在APX 催化下與活性氧反應(yīng)，在被氧化的同時(shí)將活性氧還原，GSH 除了能直接清除自由基外，還通過(guò)與GSH-PX-RX 酶系共同抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的啟動(dòng)和終止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)展［22］。在ASA-GSH 循環(huán)中，APX 氧化ASA 使ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，MDAR 和DHAR 再生ASA 使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。Okmanen［34］等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足時(shí)，APX 活性低，因此，高活性APX 與高質(zhì)量分?jǐn)?shù)ASA 一致。在低濃度鎘脅迫下，ASA 具有還原和絡(luò)合重金屬的作用，能清除植物體內(nèi)受重金屬脅迫產(chǎn)生的活性氧。但重金屬濃度超過(guò)一定界限時(shí)，ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，APX 活性降低［35］。本試驗(yàn)中，Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90 mg·kg-1時(shí)，處理20、40 d，以及Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60 mg·kg-1時(shí)，處理60 d，ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇上升至峰值，APX 活性也快速升高，加速了活性氧的清除速率。而3 個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)下APX 活性均在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 mg·kg-1才達(dá)到峰值，滯后于ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)峰值，說(shuō)明ASA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在峰值后至Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤120 mg·kg-1條件下下降的原因可能是APX 活性升高加速ASA 分解造成的。而在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150～180 mg·kg-1條件下，ASA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和APX 活性的降低可能是ASA-GSH 循環(huán)受到抑制。MDAR 和DHAR 是ASA-GSH 循環(huán)中ASA 再生的兩個(gè)重要酶，前人研究認(rèn)為，MDAR 還原MDHA 是ASA 再生的主要途徑［22，36-37］。本研究中，MDAR 活性遠(yuǎn)高于DHAR 活性，說(shuō)明在苦楝葉片中MDAR 是再生ASA 的主要酶，這與前人研究結(jié)果一致。

GR 活性影響著細(xì)胞內(nèi)GSH 質(zhì)量摩爾濃度，且與植物對(duì)逆境的抵抗能力密切相關(guān)［38］，GR 活性隨Cd2+處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加先升高后降低，GSH 質(zhì)量摩爾濃度也先升后降。GSH 質(zhì)量摩爾濃度在植物螯合肽合成酶催化下在細(xì)胞質(zhì)中聚合形成植物螯合肽(PC)，PC 具很強(qiáng)的重金屬親和力，能與重金屬離子(如Cd2+)螯合形成無(wú)毒的化合物，從而降低植物細(xì)胞內(nèi)游離的重金屬離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，減輕重金屬對(duì)植物的毒害［39］。本試驗(yàn)中，3 個(gè)處理時(shí)間下，GR 活性峰值均出現(xiàn)在Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1時(shí);而GSH質(zhì)量摩爾濃度峰值在處理20 d 時(shí)，出現(xiàn)于Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)90 mg·kg-1，處理40、60 d 時(shí)出現(xiàn)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)120 mg·kg-1時(shí)，表明適度Cd2+處理，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30、60、90 mg·kg-1，ASA-GSH 循環(huán)處于高效工作狀態(tài)。

綜上認(rèn)為，20、40 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30、60、90 mg·kg-1，以及60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30、60 mg·kg-1時(shí)，苦楝同時(shí)啟動(dòng)了大幅度提高SOD、CAT、POD 活性清除活性氧自由基機(jī)制和加速ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)高效運(yùn)行清除活性氧自由基機(jī)制，二者協(xié)同作用，維持體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，使苦楝不會(huì)受到氧化傷害;20、40 d處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90～120 mg·kg-1，60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)在60～90 mg·kg-1，主要由CAT、POD 和ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)擔(dān)任活性氧自由基的清除作用，共同抵御Cd2+脅迫帶來(lái)的氧化傷害，氧化傷害不嚴(yán)重，屬于苦楝能耐受的范圍;20、40 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)在150～180 mg·kg-1，60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)在120～180 mg·kg-1，SOD、CAT、POD活性和ASA-GSH 循環(huán)均受到一定程度的抑制，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，抑制作用越明顯，但在60 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為180 mg·kg-1時(shí)，除SOD 略低于CK外，CAT 和POD 活性分別為CK 的126%和60%，GSH 質(zhì)量摩爾濃度比CK 高15%，APX 活性比對(duì)照高33%，表明保護(hù)性酶系統(tǒng)和ASA-GSH 循環(huán)并沒(méi)有因脅迫而完全被破壞，只是受到了較大程度的抑制，表明苦楝受到相應(yīng)程度的氧化傷害，對(duì)Cd2+脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力。由此可以認(rèn)為，苦楝對(duì)Cd2+脅迫的耐受范圍為20、40 d 處理下Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于150 mg·kg-1，60 d 處理下低于120 mg·kg-1。

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