王麗娜 李開隆

(林木遺傳育種國家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:程 紅。

目前楊樹轉(zhuǎn)基因的研究主要集中在抗蟲、抗除草劑、抗病、降低木質(zhì)素、抗環(huán)境污染以及非生物脅迫等［1-3］，對(duì)光合作用環(huán)式電子傳遞鏈中的載體蛋白研究的較少，尤其是將光合與抗逆結(jié)合進(jìn)行木本植物轉(zhuǎn)基因的研究更少［4］。PGR5 在C3植物楊樹中的遺傳轉(zhuǎn)化是其功能性研究的重要方法，對(duì)PGR5 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定和表達(dá)量研究能有效地證明外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的陽性轉(zhuǎn)化效率及基因表達(dá)情況，是功能試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［5］。筆者經(jīng)過近一年的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了23 個(gè)轉(zhuǎn)基因抗性株系，對(duì)這些株系進(jìn)行PCR、RT-PCR、qRT-PCR 檢測(cè)，獲得12 個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。

1 材料與方法

1.1 材料

毛果楊(Populus trichocarpa)組培苗由中國科學(xué)研究院植物研究所光合中心王佰臣教授提供。轉(zhuǎn)基因所用材料為南林895 楊(Populus×euramericana‘Nanlin895’)組培苗，由上海植物生理生化研究所李萊庚教授提供。

大腸桿菌DH5a 為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，pCAMBIA1300 原始質(zhì)粒、GV3101 感受態(tài)菌株為中國科學(xué)研究院植物研究所王佰臣教授提供，Silica Bead DNA Gel Extraction Kit#K0513 購于北京Thermo 公司，限制性內(nèi)切酶購于北京NEB 公司，高保真酶KOD-Plus-Neo 購于TOYOBO 公司，RNA 提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(DP441)購于TIANGEN 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen 公司，克隆載體使用的北京全式金公司的pEASY-Blunt Simple Cloing Kit，TRANS2KTMDNA Marker 購于全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 普通PCR 檢測(cè)PGR5 基因

對(duì)23 個(gè)抗性株系提取總DNA，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃、1 min，60 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，PGR5 基因產(chǎn)物大小為1 000 bp，反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)［6-8］。

采用天根專門針對(duì)楊樹多糖多酚特點(diǎn)的RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)提取南林895 楊總RNA，利用Invitrogen 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(C28025-032)反轉(zhuǎn)cDNA，采用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［9］。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

鑒于內(nèi)參基因在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 中的重要作用，從內(nèi)參基因的選擇、常用內(nèi)參基因的特點(diǎn)、應(yīng)用內(nèi)參基因組合的優(yōu)越性和評(píng)價(jià)內(nèi)參基因穩(wěn)定性等幾方面選擇適合楊樹的Actin 作為內(nèi)參基因［10-12］，并設(shè)計(jì)適合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物，引物序列見表1。在熒光定量PCR 管(國盛公司)中加入10 μmol·L-1正向引物和反向引物各0.4 μL，全式金PCR Master Mix(北京全式金SYBR Green Realtime PCR Master Mix)10 μL。各反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品cDNA 各1 μL，總反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行重復(fù)。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，55℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。然后進(jìn)行55～95 ℃的熔解曲線分析，完成上述步驟后，把加好樣品的定量PCR 專用反應(yīng)管放入real- time quantity PCR儀［13］。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)量檢測(cè)所需引物序列及擴(kuò)增片段

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因楊樹DNA 水平檢測(cè)

選擇生長良好的轉(zhuǎn)PGR5 基因的生根苗，分別對(duì)23 株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行葉片基因組DNA 的提取和PCR 檢測(cè)，同時(shí)以p1300RD29A-PGR5 質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因植株南林895 楊為陰性對(duì)照(圖1)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外照射下拍照，在約1 000 bp 處出現(xiàn)一條特征條帶，與預(yù)期的PGR5 基因大小一致，而在陰性對(duì)照的泳道上未發(fā)現(xiàn)該特征帶，這初步證明PGR5 基因已經(jīng)整合到南林895 楊基因組中［14］。

2.2 轉(zhuǎn)基因楊樹RNA 水平檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因楊樹DNA 檢測(cè)結(jié)果說明PGR5 基因已插入楊樹基因組中，為檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，提取12 個(gè)陽性苗株系的葉片總RNA，提取的RNA 溶于35 μL RNase-free Water 中，取5 μL RNA 溶液點(diǎn)樣，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下拍照的結(jié)果見圖2。從圖2可以清晰的看到18 S 和28 S 的兩條帶，說明RNA 提取質(zhì)量完好，無污染未降解，可以進(jìn)行下游試驗(yàn)。

圖1 轉(zhuǎn)PGR5 基因的PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖2 12 株陽性轉(zhuǎn)PGR5 基因植株葉片總RNA

將檢測(cè)的完整的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA［15］，用PGR5 特異性引物檢測(cè)，以p1300RD29A-PGR5 質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，結(jié)果如圖3所示，1～12 泳道均擴(kuò)增出特異性條帶，與陽性質(zhì)粒對(duì)照(CK+)相一致，而陰性對(duì)照(CK-)并未擴(kuò)增出該特異性條帶，說明目的基因已經(jīng)整合到了南林895 楊基因組中并在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［16-18］。

2.3 PGR5 基因相對(duì)表達(dá)量

以Actin 作為內(nèi)參基因，對(duì)12 個(gè)轉(zhuǎn)PGR5 基因樣本的表達(dá)情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，12 個(gè)樣本均有不同程度表達(dá)，PGR5-M5 樣本表達(dá)量最高，是野生型的20 倍，PGR5-M11 約10倍，PGR5-M1、PGR5-M2、PGR5-M3、PGR5-M9 的表達(dá)量為6～10 倍，PGR5-M6、PGR5-M7、PGR5-M8的表達(dá)量均在5 倍以下，PGR5-M4 樣本表達(dá)量最低，約是野生型的2 倍。

圖3 轉(zhuǎn)PGR5 基因植株的RT-PCR 電泳檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)束語

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光下誘導(dǎo)不定芽的方法對(duì)PGR5 進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，用普通PCR 和RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了檢測(cè)和篩選，獲得了12 株轉(zhuǎn)基因陽性苗;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PGR5 基因在葉片中均高表達(dá)，最高表達(dá)量是野生型的20 倍，PGR5-M5、PGR5-M11 樣本經(jīng)多次實(shí)時(shí)熒光定量PCR 重復(fù)表達(dá)穩(wěn)定并高表達(dá);通過遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化及潮霉素篩選獲得了一批轉(zhuǎn)PGR5基因的南林895 楊植株，并準(zhǔn)備對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步的功能鑒定。

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