姚紅銳，龍子江，趙　剛 ，楊　燕 ，江　震

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥　230031;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012)

?

毛菊苣有效部位降脂作用及初步機(jī)制探討

姚紅銳1，龍子江2，趙剛1，楊燕1，江震1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥230031;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012)

摘要：目的在整體水平上，研究毛菊苣有效部位含藥血清降脂作用及初步機(jī)制 。方法利用MTT法確定血清的加入量以及尼羅紅染色建立HepG2細(xì)胞高脂模型，在此基礎(chǔ)上，檢測細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵性指標(biāo)甘油三酯(TG)和脂滴的含量,最后通過ELISA酶聯(lián)免疫吸附法分別從游離脂肪酸的吸收、氧化、TG 的合成方面對毛菊苣降脂有效部位含藥血清的降脂機(jī)制進(jìn)行初步的探討。結(jié)果通過MTT實(shí)驗(yàn)和尼羅紅染色及流式定量分析表明，脂肪乳濃度為總體積的 6%時，造模組細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量較正常對照組明顯增加，具有顯著性差異(P<0.01、0.001)；不同模型的大鼠含藥血清均可顯著性地降低HepG2細(xì)胞內(nèi)TG(P<0.05)和脂滴(P<0.01、0.001)的含量，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清降脂效果顯著；同時對TG合成、氧化、吸收通路中的關(guān)鍵酶GPAT1-2(P<0.05)、PPARγ(P<0.05 、0.01)、FATP5(P<0.01)三個指標(biāo)上的檢測表明正常狀態(tài)下的含藥血清與高脂模型組相比具有顯著性差異。 結(jié)論大鼠病理狀態(tài)下(高脂模型)與正常生理狀態(tài)下的毛菊苣降脂有效部位含藥血清具有顯著性地降低人肝癌HepG2細(xì)胞高脂模型的作用，并且后者較前者降脂效果明顯，其機(jī)制可能與減少GPAT1-2的含量、促進(jìn)PPARγ的表達(dá)和抑制FATP5的生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：毛菊苣；有效部位；含藥血清；降脂作用；初步機(jī)制

傳統(tǒng)維吾爾醫(yī)用菊苣屬植物毛菊苣(CichoriumglundulosumBoissetHout)，在臨床上主要用于抗肝炎等作用，研究表明其在降脂方面亦有明顯的療效[1]。甘油三酯(TG) 和細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的多少直接反映了機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)水平的高低。已知甘油脂類合成主要受線粒體外膜上的 GPAT1-2(mtGPAT )催化。研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)能夠增強(qiáng)脂肪酸的氧化和利用。在機(jī)體當(dāng)中，還存在著另一類與游離脂肪酸吸收高度相關(guān)的蛋白，游離脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP5)，可特異性地介導(dǎo)脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

因此，本文從整體水平上探討毛菊苣的降脂有效部位中潛在活性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的降脂作用[2-3],研究大鼠病理狀態(tài)下(高脂模型)與正常生理狀態(tài)下的毛菊苣降脂有效部位含藥血清對人肝癌HepG2細(xì)胞高脂模型的降脂作用，并且對這兩種血清降脂作用進(jìn)行比較。同時分別從游離脂肪酸的吸收，氧化，TG 的合成方面，對毛菊苣降脂有效部位含藥血清的降脂機(jī)制進(jìn)行初步的探討[4-5]。

1材料

1.1細(xì)胞人肝腫瘤細(xì)胞系 HepG2(ATCC)購自中科院上海藥物研究所。

1.2藥品與試劑毛菊苣有效部位物含藥血清(95%乙酸乙酯提取)[6]；尼羅紅(Sigma)；甘油三酯試劑盒(南京建成生物有限公司)；20%脂肪乳注射液(三菱制藥有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)；線粒體提取試劑盒(北京索寶來公司)；PPARγ、GPAT1-2、CD36、FATP5 ELISA 試劑盒(武漢優(yōu)爾生物技術(shù)有限公司)；高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。

2方法

2.1MTT法確定血清加入量將 HepG2細(xì)胞以每孔8 000個的數(shù)目加入 96 孔板中，貼壁培養(yǎng) 24 h，隨后更換無血清培養(yǎng)基，同時分別加入不同體積的大鼠溶劑對照組血清，使其含量占總培養(yǎng)基的 5%、10%、20%、40%、60%。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，加入 20 μL MTT，培養(yǎng) 4 h，取出孔內(nèi)所有液體，加入 150 μL DMSO，振搖 8～10 min，待顏色穩(wěn)定后，于510 nm處測定各孔吸光值，取平均值進(jìn)行計算。

2.2細(xì)胞高脂模型的建立[7]取對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞，以每孔 2×104的數(shù)目加入到 24 孔板當(dāng)中，培養(yǎng) 24 h，待 HepG2細(xì)胞長到 60%～70% 時，加入脂肪乳注射液，使其終濃度分別為 0、2%、4%、6%、8%(v/v)，同時更換成無血清培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后棄上清液，清洗加入尼羅紅染色液，室溫避光染色 5 min，PBS 洗滌 2 次，可直接在530～550 nm處通過熒光顯微鏡觀察測定。

2.3GPO-POD法檢測 HepG2細(xì)胞內(nèi) TG 的含量取對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞，以每孔 1×105的數(shù)目加入到 6 孔板當(dāng)中。細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，將細(xì)胞分為正常對照組、細(xì)胞高脂模型組，細(xì)胞高脂模型+各種含藥血清組，取上清，部分上清用于 BCA 法進(jìn)行蛋白定量，剩余上清根據(jù) TG 試劑盒說明書進(jìn)行 TG 含量的測定。

取對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞，以每孔 1×105的數(shù)目加入到 6 孔板當(dāng)中。細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，將細(xì)胞分為正常對照組、高脂模型組，高脂模型+各種含藥血清組，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值，取熒光強(qiáng)度幾何中位值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。降低率=(含藥血清平均熒光強(qiáng)度-正常血清平均熒光強(qiáng)度)/ 含藥血清平均熒光強(qiáng)度。

2.4ELISA 法檢測大鼠肝細(xì)胞線粒體內(nèi)GPAT1-2的含量大鼠組織樣本處理后按照GPAT ELISA 試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀 450 nm處測 OD，15 min 內(nèi)檢測，確定包被 ELISA 孔的線粒體濃度。

2.5ELISA 法檢測 HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARγ、FATP5的含量建立HepG2細(xì)胞高脂模型并給藥，用 ELISA 法在 450 nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)，計算各組 PPAPγ、FATP5 的含量。

3結(jié)果

3.1MTT法確定血清加入量對HepG2細(xì)胞增殖的影響根據(jù)圖1結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠溶劑對照組血清的加入量占培養(yǎng)基總量的 5%～20%時，不會抑制細(xì)胞的生長，故在以后的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，選擇血清藥理學(xué)通法中建議的10%為大鼠血清的加入體積比。

3.2HepG2細(xì)胞高脂模型的建立根據(jù)圖 2 結(jié)果，發(fā)現(xiàn) HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量隨著脂肪乳濃度的增加而增加，當(dāng)脂肪乳濃度達(dá)到總體積的 8% 時，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，故選擇 6%加入量為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中 HepG2細(xì)胞高脂模型造模濃度。圖3結(jié)果表明，在脂肪乳濃度為總體積的 6%時，造模組細(xì)胞內(nèi)的 TG 含量較正常對照組明顯增加，具有極顯著差異(P<0.001 )。

A0%脂肪酸B2%脂肪酸C4%脂肪酸D6%脂肪酸E8%脂肪酸

圖2尼羅紅染色觀察HepG2細(xì)胞中不同組別的脂滴含量(400×)

注：箭頭所示為細(xì)胞的脂滴。

圖3HepG2細(xì)胞中正常組和模型組甘油三酯

注：與正常組比較，**P<0.01 ，***P<0.001。

3.3大鼠含藥血清對HepG2細(xì)胞高脂模型中TG含量的影響與同組溶劑對照血清相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均能顯著降低 HepG2細(xì)胞內(nèi) TG 的含量(P<0.05 )，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清降脂效果稍強(qiáng)，但彼此沒有顯著性差異。見表1。

表1　大鼠含藥血清對不同模型的HepG2細(xì)胞

注：與對照組比較，*P< 0.05。

3.4大鼠含藥血清對HepG2細(xì)胞高脂模型中脂滴含量的影響與同組溶劑對照血清相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量(P<0.01，P<0.001)，并且正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的含藥血清的降脂滴作用更顯著。見表2。

表2　大鼠含藥血清對不同模型的HepG2 細(xì)胞

3.5大鼠含藥血清對大鼠肝細(xì)胞線粒體內(nèi)GPAT1-2含量的影響由圖 4 得知，與線粒體模型組相比，陽性藥 NEM 與兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的降低大鼠肝臟線粒體中的 GPAT1-2的含量(P<0.05)；正常組大鼠溶劑對照血清也可以顯著的降低大鼠肝臟線粒體中 GPAT1-2的含量(P<0.05)，說明大鼠含藥血清可明顯減少肝線粒體內(nèi)GPAT1-2的含量。

注：與模型組比較，*P< 0.05。

3.6大鼠含藥血清對HepG2細(xì)胞高脂模型中PPARγ含量的影響結(jié)果見圖5，與正常組比較，高脂模型組PPARγ含量顯著降低(P<0.01)；與細(xì)胞高脂模型組相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的升高 HepG2細(xì)胞高脂模型中 PPARγ 的含量(P<0.05、0.01)，說明大鼠含藥血清可明顯促進(jìn)PPARγ含量的表達(dá)。

圖5正常大鼠與高脂大鼠含藥血清對PPARγ表達(dá)的

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.7大鼠含藥血清對HepG2細(xì)胞高脂模型中FATP 5含量的影響結(jié)果見圖6，與正常組比較，高脂模型組FATP 5含量顯著升高(P<0.01)；與細(xì)胞高脂模型組相比，兩種狀態(tài)下的含藥血清均可以顯著性的降低 HepG2 細(xì)胞高脂模型中FATP 5 的含量(P<0.01)，說明大鼠含藥血清可明顯地抑制FATP 5含量的表達(dá)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P< 0.01。

4討論

結(jié)果顯示，在 TG 與細(xì)胞內(nèi)脂滴這兩種代表細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的終點(diǎn)檢測指標(biāo)方面，正常狀態(tài)下的含藥血清比病理狀態(tài)下的血清降脂效果略強(qiáng)，這可能表明病理狀態(tài)下機(jī)體確實(shí)對含藥血清當(dāng)中的有效成分有一定程度消耗；由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組含藥血清也能明顯的改善 HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積，這說明在高脂組含藥血清當(dāng)中，也存在著一些由于藥物刺激而產(chǎn)生的降脂活性物質(zhì)[8-9]。

從 GPAT1-2、 PPARγ和 FATP5 這 3個與 TG 的合成、FFA的氧化和吸收有關(guān)的指標(biāo)來看，兩種狀態(tài)下的血清都有明顯的恢復(fù)作用，并且彼此之間沒有差別，說明在一般情況下，兩種模型的含藥血清都可以進(jìn)行血清藥理學(xué)研究[10]。此外，在 GPAT1-2和 FATP5 這 2 個指標(biāo)當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)溶劑對照組血清與模型組相比，也有明顯的保護(hù)作用，說明血清內(nèi)本身就含有多種生物活性因子，從而對機(jī)體起到一定的保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)毛菊苣降脂有效部位的含藥血清能夠降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的含量，同時也能顯著性的改善由于細(xì)胞高脂模型所引起的脂質(zhì)代謝相關(guān)靶點(diǎn)的紊亂，說明毛菊苣降脂有效部位能夠從整體上，多角度的調(diào)節(jié)脂類的生成與代謝，為毛菊苣的降脂物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供一點(diǎn)依據(jù)[11-12]。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010:291.

[2]吳啟轉(zhuǎn),袁其朋,陳養(yǎng)文.紫錐菊中菊苣酸提取純化工藝研究[J].中草藥,2004,35(9):995-997.

[3]張堯卜,信學(xué)雷.維藥毛菊苣降糖有效部位的純化工藝[J].中成藥,2012,34(12):2322-2325.

[4]李靜,殷飛,姚樹坤.血清藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(3):234-236.

[5]韓笑,劉建勛,林成仁.血清藥理學(xué)關(guān)鍵問題的存疑與討論[J].中藥藥理與臨床,2009,25(2):122-124

[6]底雪梅,閆福林.毛葉香茶菜化學(xué)成分研究[J].安徽醫(yī)藥,2013,17(9):1470-1472.

[7]徐叔云,謝強(qiáng)敏.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1328.

[8]游思湘,毛春季.復(fù)方黃連注射劑血清藥理學(xué)研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(8):1873-1875.

[9]苗宇船,李明磊.降脂平肝湯含藥血清對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(5):207-210.

[10] 朱梅菊，郭振球.抗纖靈藥物血清對人肝癌細(xì)胞(HepG2)的體外生長抑制作用[J].中草藥,2001,32(10)： 905-907.

[11] Wang Y,Yu L,Zhang L,et al.A novel methodology for multicomponent drug design and its application in optimizing the combination of active components from Chinese medicinal formula shenmai[J].Chem Biol Drug Des,2010,75(3):318-324.

[12] Hao HP,Zheng CN,Wang GJ.Thoughts and experimental exploration on pharmacokinetic study of herbal medicines with multiple-components and targets[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2009,44(3):270-275.

Lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum

and its preliminary mechanism

YAO Hong-rui1,LONG Zi-jiang2,ZHAO Gang1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,

Hefei230031,China;2.DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofTCM,Hefei230012,China)

Abstract:ObjectiveTo explore lipid-lowering effect of the effective parts of Cichorium glundulosum and its preliminary mechanism.MethodsMTT method was used to determine the amount of serum,as well as Nile red staining to establish hyperlipidemia model of HepG2cells.On this basis,the content of key index TG and the lipid droplets were determined.Finally,ELISA enzyme-linked immunosorbent assay was used to make a preliminary study of the lipid-lowering mechanism of Cichorium glundulosum effective parts from the aspects of the absorption,oxidation and TG synthesis of free fatty acid.ResultsIt was showed that,through MTT experiment and Nile red staining and the flow type quantitative analysis,fat drops content of module cell was obviously increased more than that of control group and had significant difference (P< 0.01 and 0.001) when fat breast concentration was 6% of the total volume;content of TG (P<0.05) and fat drops (P<0.01 and 0.001) of HepG2cells were significantly reduced in different models of rat,and medicated serum in normal state had more significant lipid-lowering effect than that in pathological state.And tests of the three indexes GPAT1-2(P<0.05),PPARγ (P<0.05 and 0.01),FATP5(P<0.01) showed that there was significant difference between medicated serum in normal state group and that in high lipid model group.ConclusionsMedicated serum with the effective parts of Cichorium glundulosum in pathological state (high lipid model) or in normal state can both significantly lower hyperlipidemia model of human hepatoma cell line HepG2cells and the latter had more significant lipid-lowering effect,the mechanism of which may be related to reducing the content of GPAT1-2,promoting the expression of PPARγ and inhibiting the FATP5 generation.

Key words:Cichorium glundulosum;effective parts;medicated serum;lipid-lowering effect;preliminary mechanism

(收稿日期：2015-05-30，修回日期：2015-07-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.10.006

通信作者：龍子江，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及復(fù)方藥理作用及機(jī)制研究，E-mail：942615693@qq.com

基金項(xiàng)目：安徽高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目 (No KJ2014Z150)