馮秋月, 劉 瀅, 劉媛媛, 楊云霞, 王安如,*

（1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100192；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

光化學(xué)衍生檢測玉米中4種黃曲霉毒素

馮秋月1, 劉 瀅1, 劉媛媛1, 楊云霞2, 王安如1,*

（1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100192；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

建立了HPLC-免疫親和柱凈化，柱后光化學(xué)衍生檢測玉米中4種黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的分析方法。玉米樣品提取、濃縮、過濾后經(jīng)免疫親和柱凈化，液相色譜分離后采用光化學(xué)衍生器對黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2進(jìn)行在線衍生，通過配制熒光檢測器的液相色譜同時檢測玉米中B1，B2，G1，G2這4種黃曲霉毒素。結(jié)果表明，4種黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的色譜分析時間在6～11 min內(nèi)完成，檢測定量限分別為：0.10，0.03，0.10，0.03 μg/kg，完全符合并高于歐盟檢測標(biāo)準(zhǔn)定量限，通過光化學(xué)衍生器在線衍生將B1、G1的分析定量限提高到2.7倍和3.6倍。玉米基質(zhì)中B1，B2，G1，G2在添加水平為10，3，10，3 μg/L時其回收率分別為：90.3%，85.6%，93.5%，92.8%。其線性范圍分別為0～20 μg/L，0～6 μg/L，0～20 μg/L，0～6 μg/L，RSD分別為2.3%，1.5%，2.7%，3.2%。文章建立了分析玉米中4種黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的分析方法，經(jīng)驗證該方法定性準(zhǔn)確，定量靈敏度高，可同時檢測出玉米中4種黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2含量。

黃曲霉毒素；玉米；高效液相色譜；免疫親和柱；光化學(xué)衍生

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）是由曲霉屬中的黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一類含有雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)相似的毒性極強的次生代謝產(chǎn)物［1］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2等20余種，是具有極強致畸、致癌、致突變性的一組化合物。常存在于花生、玉米、牛奶等食物中。玉米不只被人類直接食用，也是主要的飼料原料。玉米在我國作為飼料原料被廣泛應(yīng)用于動物飼養(yǎng)方面。據(jù)許力偉等表明飼喂黃曲霉毒素9周的大鼠，在改喂常規(guī)飼料兩年后即出現(xiàn)肝癌［2-4］。

黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法以及質(zhì)譜檢測法等。薄層層析法測定黃曲霉毒素其前處理方法復(fù)雜，試劑消耗巨大，極其危害身體健康，且其專一性差，為一種半定量方法。酶聯(lián)免疫吸附法實驗步驟簡單，但所需抗體壽命很短并且需要低溫保存，檢測假陽性率比較高，只適合于大量樣品的篩選，并不能精準(zhǔn)定量。質(zhì)譜法雖然靈敏度高，但儀器成本也高，很多實驗室不具備［5-8］。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2在紫外激發(fā)下產(chǎn)生熒光，但在水溶液中B1、G1容易發(fā)生熒光淬滅，所以需要采用衍生方法增強熒光信號。目前衍生方法主要有三氟乙酸衍生法，碘衍生法等，三氟乙酸衍生法實驗步驟復(fù)雜，重復(fù)性差，且三氟乙酸毒性很強，嚴(yán)重危害身體健康；碘衍生法操作復(fù)雜，受衍生劑影響很大，并且其腐蝕性強，容易對儀器造成損耗［9-10］。光化學(xué)衍生器內(nèi)部是一定長度的聚四氟乙烯管固定于254 nm紫外燈照射的不透光的反應(yīng)池架里，當(dāng)黃曲霉毒素B1、G1流過時，受到紫外光照射后被衍生成熒光性較強的黃曲霉毒素B2a和G2a，從而提高了檢測靈敏度，原理見圖1。因此光化學(xué)衍生器不需要其他化學(xué)試劑，只是連接到色譜柱和檢測器之間，其操作簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，所以本研究采用免疫親和柱對樣品進(jìn)行凈化、富集，光化學(xué)衍生器在線對黃曲霉毒素B1、G1衍生，液相色譜法熒光檢測器檢測樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的含量［11-14］。

圖1 黃曲霉毒素B1及G1紫外光照射原理圖Fig.1 UV irradiation schematic of AFT B1 and AFT G1

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Inertsil ODS-3型（4.6 mm×250 mm×5 μm）色譜柱購自島津公司；黃曲霉毒素免疫親和柱購自ROMER公司；玻璃纖維濾紙購自WHATMAN公司；甲醇、乙腈均為色譜純；水為Millipore過濾水；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（1 g/mL）購自SUPELCO公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SIL-20AC型高效液相色譜儀，日本島津公司；Milli-Q型超純水儀，Millipore公司；Microfuge?18型離心機，美國Beckman公司；光化學(xué)衍生器，ROMER公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甲醇為溶劑，用購買的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品配制成以下混合標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液并做梯度濃度曲線：B2和G2梯度濃度分別為：0，0.06，0.30，1.50，3.00，6.00 μg/L，B1和G1梯度濃度分別為：0，0.2，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/L。

1.3.2 樣品的制備

樣品粉碎后，準(zhǔn)確稱取4 g于50 mL離心管中，加入0.8 g氯化鈉和20 mL φ（甲醇）=30%的水溶液，混合后振蕩提取15 min，其后4 000 r/min離心5 min。取上清8 mL并加入24 mL水，混勻后用纖維濾紙過濾備用。準(zhǔn)確移取20 mL上述樣品提取液，以2 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，以20 mL水淋洗兩次后吹干去除水分，準(zhǔn)確加入1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并過濾于上樣瓶中準(zhǔn)備上樣。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相：V（水）∶V（甲醇）=43∶57；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL/min；柱溫35℃；檢測器是熒光檢測器前連接光化學(xué)衍生器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.3.4 樣品加標(biāo)回收實驗及精密度實驗

取陰性對照6份，精確加入黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的濃度為10，3，10，3 μg/kg，按照1.3.2節(jié)制備6份平行樣品進(jìn)行實驗檢測回收率。

1.3.5 實際樣本的檢測

隨機選取16份由某5個公司提供的樣品，編號為1～16，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行前處理，進(jìn)行上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種黃曲霉毒素的色譜分析結(jié)果

按照本實驗方法和色譜條件，4種黃曲霉毒素的色譜分析時間分別為7.1，7.8，8.9，10.1 min，4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2（箭頭所指較高色譜峰為光化學(xué)衍生后色譜峰）。在連接光化學(xué)衍生器后，黃曲霉毒素B1和G1峰面積明顯提高，分別是原峰面積的2.7倍和3.6倍，極大地提高了檢測的靈敏度。

圖2 4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生前后的HPLC對比>Fig.2 Chromatograms of 4 AFTs before and after deratization

2.2 線性范圍和檢測定量限

在本實驗方法下，按照1.3.1節(jié)制備黃曲霉毒素混合物標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明各組分濃度C與其峰面A積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.999。以S/N=10的信噪比確定最低檢測定量限，結(jié)果為黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2檢測定量限分別為0.10，0.03，0.10，0.03 μg/kg。圖3為黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 黃曲霉毒素的回歸結(jié)果及方法定量限Tab.1 Regression results and quantitative limits of AFTs

圖3 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of AFT B1

2.3 樣品加標(biāo)回收試驗及精密度實驗

在黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2添加水平為10， 3，10，3 μg/L時其回收率分別為90.3%，85.6%，93.5%，92.8%。RSD分別為2.3%，1.5%，2.7%，3.2%，均小于5%，如表2所示。

表2 樣品加標(biāo)回收率及RSD試驗Tab.2 Recovery and relative standard deviation of samples

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

對16份樣品進(jìn)行檢測，其中有3份廠址位于南方的公司提供的樣品含有黃曲霉毒素，具體結(jié)果如表3。圖4為樣品2的HPLC圖譜。因為提供樣品時間為5月份，此時南方正是梅雨季節(jié)，玉米發(fā)霉導(dǎo)致黃曲霉毒素B1超過限量標(biāo)準(zhǔn)，此批樣品注意監(jiān)控，不要流入市場。

表3 樣品中黃曲霉毒素含量Tab.3 AFTs concentration of samples

3 結(jié)果與討論

玉米不僅直接供人類食用，還是一種主要的飼料原料，玉米中黃曲霉毒素的污染不僅直接造成人類植源性食品污染還是人類動物源性食品安全的源頭。我國對玉米中黃曲霉毒素B1限量最低為5 μg/kg，歐盟規(guī)定直接食用花生中黃曲霉毒素B1限量為2 μg/kg，對B1，B2，G1，G2總量為4 μg/kg，GB/T 18979—2003使用柱后碘衍生法進(jìn)行衍生檢測黃曲霉毒素，該方法操作復(fù)雜，重現(xiàn)性差，因此本文結(jié)合實際應(yīng)用建立了免疫親和柱-光化學(xué)衍生法對玉米中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2進(jìn)行檢測。本方法在玉米基質(zhì)中B1，B2，G1，G2添加水平為10，3，10，3 μg/L時，回收率分別為：90.3%，85.6%，93.5%，92.8%；線性范圍分別為0～30 μg/L，0～9 μg/L，0～30 μg/L，0～9 μg/L；RSD分別為2.3%，1.5%，2.7%，3.2%，均小于5%，具有操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點。

圖4 樣品2中黃曲霉毒素HPLCFig.4 Chromatogram of AFTs in sample 2

本方法與薄層色譜法［6］、酶聯(lián)免疫吸附法以及質(zhì)譜檢測法［8］等方法相比，其樣品前處理簡單，只需在色譜柱及檢測器之間連接光化學(xué)衍生器即可進(jìn)行衍生，完成樣品的分析檢測，儀器成本低，專一性高。與常用的柱后碘衍生法相比，本方法具有節(jié)省時間，避免化學(xué)試劑的毒害，消除實驗操作誤差，提高重復(fù)性的優(yōu)勢。本方法B1、G1回收率高于文獻(xiàn)［11］中報道的三氟乙酸衍生法（81.5%～106.2%）。與目前報道的同類光化學(xué)衍生方法相比，本方法的檢測定量限分別為：0.1，0.03，0.1，0.03 μg/kg，低于陳冬東等［14］（0.12，0.06，0.16，0.11 μg/kg）、王桂苓等［15］（0.1，0.05，0.1，0.05 μg/kg）等研究。

本方法采用免疫親和柱對玉米中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2進(jìn)行富集、凈化、濃縮，在色譜柱及檢測器之間連接光化學(xué)衍生器在線對黃曲霉毒素G1、B1衍生提高了熒光檢測器對G1、B1的靈敏度從而提高了G1、B1檢測限，既可完成樣品中并能準(zhǔn)確應(yīng)用于實際樣本測量中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢測，具有便捷、靈敏、準(zhǔn)確、儀器成本低等特點，具有較高的推廣應(yīng)用價值。

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Determination of Aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in corn by HPLC with Photochemical Derivation

FENG Qiuyue1， LIU Ying1， LIU Yuanyuan1， YANG Yunxia2， WANG Anru1，*
（1.State Key Laboratory of Direct-Fed Microbial Engineering，Beijing Da Bei Nong Science and Technology Group Co.Ltd.，Beijing 100192，China；2.Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-product of CAAS，Beijing 100081，China）

A method for the determination of aflatoxin B1，B2，G1，and G2 in corn by high performance liquid chromatography（HPLC）with immunoaffinity column and photochemical derivatization was established.Samples were extracted，concentrated，and filtered purified by immunoaffinity column，and aflatoxin B1 and G1 were derivatived using photochemical derivatization unit after the HPLC separation. Then four aflatoxins B1，B2，G1，and G2 were analyzed by HPLC with fluorescence detector.Results showed that the peak elution time of four aflatoxins B1，B2，G1，and G2 were in the range of 6-11 minutes.Meanwhile，the detection limit of quantitation of four aflatoxins were 0.10，0.03，0.10，and 0.03 μg/kg，which was above the limit of quantitation of AFTs in EU regulation，and the detection limit of quantitation of B1 and G1 enhanced to 2.7 times and 3.6 times.The recoveries of four aflatoxins were 90.3%，85.6%，93.5%，and 92.8%when the concentration of B1，B2，G1 and G2 were 10，3，10，3 μg/L.The linearity range of B1，B2，G1，and G2 were 0-20，0-6，0-20，and 0-6 μg/L，and relative standard deviation were 2.3%，1.5%，2.7%，and 3.2%.This method was accurately and sensitively to analysis four aflatoxins B1，B2，G1，G2 in corn.

aflatoxins；corn；high performance liquid chromatography；immunoaffinity column；photochemical derivatization

李 寧）

TS210.7

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.012

2095-6002（2015）05-0069-05

馮秋月，劉瀅，劉媛媛，等.光化學(xué)衍生檢測玉米中4種黃曲霉毒素［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（5）：69-73.

FENG Qiuyue，LIU Ying，LIU Yuanyuan，et al.Determination of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in corn by HPLC with photochemical derivation［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：69-73.

2014-12-09

國家“973”重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2012CB723702）；國際科技合作項目（2011DFA32330）。

馮秋月，女，碩士，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究；*王安如，男，高級工程師，博士，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。通信作者。