梁文裕,楊　佳,吳詩杰,焦廣飛,王淑萍,徐婷婷

(1 寧夏大學 生命科學學院,銀川 750021;2 福建農林大學 生命科學學院,福州 350002)

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發(fā)菜耐旱相關蛋白NXL-01的基因克隆與表達分析

梁文裕1,楊佳1,吳詩杰1,焦廣飛2,王淑萍1,徐婷婷1

(1 寧夏大學 生命科學學院,銀川 750021;2 福建農林大學 生命科學學院,福州 350002)

摘要:在發(fā)菜耐旱差異蛋白質組學研究中,發(fā)現假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱脅迫條件下表達量逐漸增加。根據已知氨基酸序列設計簡并引物克隆NXL-01基因,長度為327 bp(GenBank登錄號為HM854288)。生物信息學分析表明,該基因具有較高保守性,蛋白質二級結構主要由α螺旋和隨機卷曲構成,是親水性的膜外蛋白,有5個Ser磷酸化位點,1個Thr磷酸化位點。將NXL-01基因在大腸桿菌中表達,獲得預期大小的重組蛋白(12.4 kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01 mRNA在干旱脅迫條件下表達量逐漸增加,與NXL-01蛋白的表達趨勢一致。

關鍵詞:發(fā)菜;假定蛋白NXL-01;干旱脅迫;基因克隆;原核表達

干旱是影響植物的最主要非生物脅迫因素之一。植物對干旱脅迫的響應根本上決定于基因的時空表達與調節(jié)[1-3]。這些基因至少可分為兩類,一類是用于防止細胞脫水的結構基因,另一類是脅迫誘導的與基因表達和信號傳導有關的調節(jié)基因。這些干旱脅迫誘導基因產物不僅通過重要代謝蛋白保護細胞結構,而且起調節(jié)信號傳導和基因表達的作用。隨著分子生物學技術不斷發(fā)展,人們對植物抗旱相關基因表達的研究越來越集中到特異基因的分離克隆及其在干旱脅迫過程中的特異表達[4-5]方面。

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種分布于干旱半干旱荒漠草原地區(qū)的陸生固氮念珠藻,在結構和生理上表現出強烈的旱生生態(tài)適應性[6-8]。在發(fā)菜耐旱蛋白質組學研究中,獲得了大量差異表達的蛋白,其中假定蛋白(hypothetical protein NXL-01)在2-DE圖譜上顯示的分子量為12.2 kD,pI為4.59,它在干旱脅迫條件下表達量明顯高于吸水條件下的表達量[6]。這種變化表明該蛋白可能在發(fā)菜耐旱機制中具有重要作用。本研究根據串聯質譜分析所得的肽段氨基酸序列,設計簡并引物克隆NXL-01基因并進行生物信息學分析,研究其原核表達和干旱脅迫下轉錄水平變化,為進一步研究發(fā)菜NXL-01結構及其在干旱防御和脅迫應答等方面的功能提供依據。

1材料和方法

1.1材料

發(fā)菜采自寧夏香山發(fā)菜自然生長地,人工模擬發(fā)菜生長環(huán)境進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃,光周期為12 h光照/12 h黑暗,光照強度為200 μmol·m-2·s-1。每天供水1次,供水量一致,使發(fā)菜充分吸脹。培養(yǎng)30 d后測定光合速率和呼吸速率,確保處于正常生長狀態(tài)(與野生狀態(tài)對照)。樣品處理:發(fā)菜藻體充分吸水4 h(4HAR),藻體含水量為(835±10)%;發(fā)菜藻體充分吸水4 h后干旱脅迫48 h(48HAD),藻體含水量為(9.5±2)%。將樣品立即放入液氮中冷凍后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1發(fā)菜NXL-01基因PCR擴增發(fā)菜基因組DNA提取參考梁文裕等的方法[6]。

根據NXL-01的MALDI-TOF-TOF/MS肽質量指紋圖譜測定的部分氨基酸序列設計簡并引物,上游引物為P1(5′-ATGAGTAACCC(C/A)CT(T/A)GTACA-3′),下游引物為P2[5′-(C/T)TA(C/T)(G/A)CAGAA(G/C)T(T/A)CTGCGAT-3′]。PCR擴增條件為94 ℃預變性8 min,94 ℃變性 50 s,49 ℃退火50 s,72 ℃復性1 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物經1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳后,回收純化連接到pMD18-T載體上,然后轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆,PCR檢測后送至天根公司測序。

1.2.2序列分析將測序結果進行BLAST檢索,進行基因確認。運用DNAMAN軟件對基因序列及推導出的氨基酸序列與其他物種進行同源性比較分析。運用DNAstar 6.0軟件對氨基酸序列進行分析。利用瑞士生物信息學研究所(Swiss Institute of Bioinformatics,SIB)ProtScale程序Kyte和Doolittle算法,對發(fā)菜NXL-01氨基酸序列做親/疏水性分析。利用DNAMAN、PBILLYON-GERLAND信息庫、SWISS MODEL網站和DNAStar軟件對Hypothetical protein NXL-01二級結構進行預測分析。利用丹麥科技大學(DTU)TMHMM Server v.2.0程序進行NXL-01序列跨膜區(qū)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;參數選擇:Extensive with graphics)。利用丹麥科技大學(DTU)NetPhos 2.0 Server程序對NXL-01做磷酸化位點分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切純化的PCR產物和pET-28a載體,回收酶切產物,連接目的基因與載體片段,轉化DH5α感受態(tài)細胞,Kan抗性篩選陽性克隆,提取質粒酶切鑒定,鑒定正確的質粒轉化BL21感受態(tài)細胞,以終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導NXL-01表達。12.5% SDS-PAGE電泳檢測并分析。

1.2.4發(fā)菜總RNA提取及反轉錄發(fā)菜總RNA提取、去除基因組DNA和總RNA純度測定等參照Liang[6]的方法。將去除基因組DNA的RNA直接作為反轉錄模板,反應體系25 μL。反應體系包含RNA模板10 μL,DEPC水5 μL,6個堿基的隨機引物pd(N)6(20 μmol/L)1 μL,混勻后于70 ℃反應5 min,冰浴5 min,再依此加入5×MMLV RT Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol/L)2 μL,RNase Inhibitor HPRI 1 μL,MMLV RNase H 1 μL?；靹蚝笥?2 ℃反轉錄1 h。反應產物可直接用于PCR反應或-20 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5NXL-01表達的RT-PCR分析利用OMIGA2軟件設計發(fā)菜NXL-01引物。上游引物RT-P1(5′-AAGTTCTGCGATAATGTTG-3′),下游引物RT-P2(5′-GAGCAGTGGCTGAAGTAGT-3′),16s rRNA的p1(5′-CTGACACTGAGGGACGAA-3′)和p2(5′-CGGGACTTAACCCAACATT-3′)為內標基因的上下游引物。

提取吸水和干旱脅迫條件下發(fā)菜總RNA,按照前述反轉錄方法分別合成cDNA后進行RT-PCR。先取不同的cDNA各1 μL,以16s rRNA基因作為內標,根據其RT-PCR產物亮度調節(jié)需要加入cDNA模板的量,然后再根據確定的cDNA模板量進行NXL-01的RT-PCR檢測。PCR擴增條件為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性50 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,共進行28個循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.3數據處理

將所得實驗數據用SPSS 13.0進行方差分析,檢驗結果的差異顯著性。

2結果與分析

2.1發(fā)菜NXL-01基因的PCR擴增及目的片段的克隆

將以發(fā)菜總DNA為模板進行PCR擴增的產物經1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到一條長與預期大小相符的DNA擴增片段(圖1)。

用DNA膠回收試劑盒回收目的片段連接到pMD18-T載體上,轉化到大腸桿菌DH5a,挑選陽性單菌落進行PCR鑒定,擴增產物在500 bp處出現特異性條帶,表明外源目的片段已成功克隆(圖2)。

2.2發(fā)菜NXL-01基因序列測定及同源分析

為進一步鑒定所得到的DNA片段是否確為NXL-01基因,運用pMD18-T載體通用引物對目的DNA片段進行雙向測序。結果表明,目的DNA片段大小為327 bp。把測序結果提交NCBI進行BLAST檢索,確定獲得了發(fā)菜NXL-01基因編碼序列,GenBank登錄號為HM854288(圖3)。

由NXL-01基因序列所推譯的氨基酸序列表明NXL-01包含108個氨基酸殘基。通過DNAstar 6.0分析表明NXL-01分子量為11.765 kD,等電點為4.42,帶電荷總氨基酸為29.63%,極性氨基酸占25.00%,疏水氨基酸占37.96%,酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占17.59%和10.19%。在Hypothetical protein NXL-01中含量豐富的氨基酸(頻率)分別為Ala(13.89%)、Leu(11.11%)、Glu(10.19%)、Arg(9.26%)、Asp(7.41%)、Ser(7.41%)、Val(7.41%)。

應用DNAMAN軟件將發(fā)菜NXL-01基因核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank中收錄的相關序列進行BLAST比較,發(fā)現發(fā)菜NXL-01基因具有較高保守性,與點形念珠藻(N.punctiformePCC73102)假定的保守蛋白基因核苷酸相似性達93%,氨基酸相似性達92%;與泡沫節(jié)球藻(NodulariaspumigenaCCY 9414)假定保守蛋白基因核苷酸相似性達81.7%,氨基酸相似性為81.5%;與多變魚腥藻(AnanaenavariabilisATCC 29413)基因核苷酸相似性為78.3%,氨基酸相似性為80.6%;與念珠藻(Nostocsp.PCC 7120)基因核苷酸相似性為77.4%,氨基酸相似性達79.6%。而與顫藻(Oscillatoriasp.PCC 6506)基因核苷酸序列和氨基酸相似性最低,分別為59.3%和62.0%(圖4)。

圖1　NXL-01基因PCR擴增結果

圖2　NXL-01基因重組質粒陽性轉化子

2.3發(fā)菜NXL-01的疏水性、跨膜區(qū)、磷酸化位點分析及二級結構預測

對發(fā)菜NXL-01氨基酸序列疏水性分析表明,在第101位的Glu親水性最強,第12位的Gly疏水性最強。從整體來看,親水性氨基酸主要分布在肽鏈的中部,且多于疏水性氨基酸。整個多肽鏈表現為親水性,表明NXL-01是親水性蛋白。

利用丹麥科技大學(DTU)的CBS服務器上的TMHMM Server v.2.0程序進行蛋白序列跨膜區(qū)分析。結果表明,NXL-01為膜外蛋白。

利用NetPhos 2.0 Server程序對蛋白序列中的Ser、Thr和Tys 3種氨基酸殘基可成為磷酸化位點作出預測。結果表明,發(fā)菜NXL-01有5個Ser磷酸化位點,分別位于第68、71、76、77、107位。有1個Thr磷酸化位點,位于106位。

運用DNAMAN軟件、PBILLYON-GERLAND信息庫、SWISS MODEL網站和DNAStar軟件對NXL-01二級結構進行預測分析表明,4種方法預測的二級結構中,雖然不同結構的氨基酸數目和百分比有一定差異,但這主要是由于方法和原理不同所導致的。綜合分析認為,發(fā)菜NXL-01二級結構主要是由α螺旋和隨機卷曲構成(表1)。

2.4NXL-01在E.coli中的表達

以質粒pMD18-T-NXL-01為模板,PCR擴增NXL-01基因。將PCR擴增產物回收純化,用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后,與同樣經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的質粒pET28a(+)相連接,獲得NXL-01基因表達載體pET28a-NXL-01。將重組質粒pET28a-NXL-01轉化到大腸桿菌培養(yǎng),通過卡納青霉素抗性挑選陽性克隆,提取質粒進行PCR和雙酶切驗證。pET28a-NXL-01經雙酶切后,在380 bp處出現1條特異條帶,與預期片段大小一致(圖5)。測序結果表明插入的DNA片段就是NXL-01基因。

將pET28a-NXL-01陽性質粒轉化到BL21感受態(tài)細胞中,并以IPTG誘導NXL-01蛋白表達,12.5% SDS-PAGE電泳,結果表明有大量外源蛋白表達(圖6),參照蛋白分子量標準,外源蛋白分子量約為12.4 kD,與預測的NXL-01分子量相同。經凝膠掃描測定,IPTG誘導5 h后外源蛋白約占細菌蛋白總量的68.7%。

圖3　發(fā)菜NXL-01的核苷酸序列(上行)及推導氨基酸序列(下行)

圖4　NXL-01核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)系統進化樹

分析方法Methodα螺旋αhelixβ折疊βstrands轉角Turn隨機卷曲RandomcoilDNAMAN76*(70.37%)**3(2.78%)029(26.86%)PBILLYON-GERLANDHopfield(HNN)79(73.15%)0029(26.85%)SWISSMODEL84(77.78%)2(1.85%)022(20.37%)DNAStar(Garnier-Robson)81(75.00%)1(0.93%)13(12.04%)13(12.04%)

注:*.氨基酸數目;**.占全部氨基酸的百分比。

Note:*.Amount of amino acid;**.Amino acid in total percentage.

圖5　重組表達載體pET28a-NXL-01酶切分析

圖6　NXL-01蛋白在大腸桿菌中表達的

圖7　干旱脅迫條件下發(fā)菜NXL-01的

2.5發(fā)菜干旱脅迫條件下NXL-01基因表達特征

提取不同干旱條件下發(fā)菜總RNA,并進行定量。取等量總RNA進行反轉錄,并取等量反轉錄產物進行RT-PCR擴增,最后取等量PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳分析。結果(圖7)表明,在干旱脅迫條件下表達量明顯高于充分吸水時的表達量(P<0.05),這與NXL-01在干旱脅迫下的表達趨勢基本一致。

3討論

對某一新蛋白進行生物信息學分析是研究蛋白質最基本和最常用的方法,多數情況下可以發(fā)現該蛋白的同源性或其擁有的家族成員,并且可以通過已知功能的其它成員對所關注蛋白功能、進化速度等做出合理推斷[9-10]。本研究根據干旱脅迫條件下差異表達的NXL-01氨基酸序列設計簡并引物,成功克隆發(fā)菜中NXL-01基因。同源性比較發(fā)現發(fā)菜NXL-01基因具有較高保守性,與點形念珠藻(N.punctiformePCC 73102)假定的保守蛋白基因核苷酸相似性達93.3%,氨基酸相似性達91.7%。生物信息學分析表明NXL-01是一種親水性膜外蛋白,其Ser有5個磷酸化位點,Thr有1個磷酸化位點。二級結構預測表明發(fā)菜NXL-01主要由α螺旋和隨機卷曲構成。這為進一步研究發(fā)菜NXL-01結構及其在發(fā)菜干旱防御和脅迫應答以及提高發(fā)菜抗旱機制等方面奠定了基礎。此外,本研究構建了發(fā)菜NXL-01高效表達載體,5 h的表達量占可溶性蛋白65 %以上,且以可溶性蛋白的形式存在,為今后利用工程菌大量生產NXL-01提供了試驗依據。

蛋白質(酶)是基因表達的產物,蛋白質生物學功能的發(fā)揮是多個因素綜合作用的結果。發(fā)菜NXL-01的表達與其生長發(fā)育和所處的環(huán)境密切相關。發(fā)菜生長于極端干旱的環(huán)境中,其風干含水量在7.3%～11.2%之間,飽和含水量在616%～1 258.4%之間,相對含水量極低,只有1%左右,與其他旱生植物相比,對極端干旱環(huán)境具有更強的適應能力[11]。此外,發(fā)菜在干旱脅迫條件下,新陳代謝減弱,光合活性降低,固氮能力下降,而恢復吸水時,光合活性和固氮能力升高[12-14]。本研究表明,NXL-01 mRNA在干旱脅迫條件下表達量逐漸增加,與NXL-01的2-DE的結果一致[6],這一結果暗示NXL-01在發(fā)菜耐旱作用中可能發(fā)揮了重要作用。然而,發(fā)菜在其生長發(fā)育和耐旱過程中,NXL-01究竟是單獨起到抗逆作用還是與其他因素相互影響共同抵御干旱環(huán)境的,仍需要深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression of Hypothetical Protein NXL-01 Related

to Drought-tolerant inNostocflagelliforme

LIANG Wenyu1,YANG Jia1,WU Shijie1,JIAO Guangfei2,WANG Shuping1,XU Tingting1

(1 School of Life Sciences,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2 College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Nostocflagelliformeis a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacteria being strong drought ecological adaptability.An unknown protein related to drought-tolerant,named hypothetical protein NXL-01,has been discovered by the proteomic analysis under drought stress.NXL-01 gene was cloned by designed degeneracy primers based on identified amino acid sequences.A full length of 327 bp DNA was obtained(GenBank access number:HM854288).Bioinformatics analysis showed that theNXL-01 gene was highly conservative.The secondary structure of NXL-01 was made up of α helix and random coil.It was a hydrophilic outside membrane protein with five Ser phosphorylation sites and one Thr phosphorylation site.NXL-01 was expressed inE.coli,and a 12.4 kD heterologous protein was observed.RT-PCR showed that mRNA level ofNXL-01 gradually increased,consistent with the expression trend of NXL-01 inN.flagelliformeunder drought stress.

Key words:Nostocflagelliforme;hypothetical protein NXL-01;drought stress;gene clone;prokaryotic expression

*通信作者:易自力,博士,教授,博士生導師,主要從事生物質能源研究。E-mail:yizili889@163.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

作者簡介:梁文裕(1969-),男,博士,教授,主要從事植物資源及植物分子生物學的研究。E-mail:liangwy2009@163.com 黃麗芳(1976-),女,碩士,助理研究員,主要從事生物新能源品種選育與栽培技術研究。E-mail:hlf20060829@163.com

基金項目:國家自然科學基金(31360054;31060038) 863課題(2011AA10020901);美國孟德爾生物技術公司合作項目(SR0373)

收稿日期:2014-07-23;修改稿收到日期:2014-11-03 2014-08-06;修改稿收到日期:2014-11-03

文章編號:1000-4025(2015)01-0044-06 1000-4025(2015)01-0050-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0044 10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0050