趙曾強,韓澤剛,李會會,李瀟玲,張　析,張　薇

(石河子大學 農(nóng)學院,新疆石河子 832000)

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棉花GhWRKY44基因的克隆與表達分析

趙曾強,韓澤剛,李會會,李瀟玲,張析,張薇*

(石河子大學 農(nóng)學院,新疆石河子 832000)

摘要:該研究以枯萎病菌誘導棉花根部基因表達譜中篩選得到的WRKY基因片段為探針,通過電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù),從高抗枯萎病品種‘中棉所12’中克隆到1個與抗枯萎病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因GhWRKY44(GenBank登錄號KJ801807)。序列分析表明,GhWRKY44基因開放閱讀框1 197 bp,編碼398個氨基酸,含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu),屬于棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第Ⅰ類;系統(tǒng)進化分析顯示,GhWRKY44基因與擬南芥AtWRKY44親緣關(guān)系最近。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測該基因表達特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯萎病菌誘導后,GhWRKY44基因在抗病品種中優(yōu)勢表達,隨處理后時間的推移,其表達量呈先增加后降低再增加的變化趨勢,處理后3 h時GhWRKY44基因表達量達到最大;而在感病品種中,GhWRKY44基因表達水平明顯低于抗病品種,對病原菌響應時間也晚于抗病品種,處理后6 h時GhWRKY44基因表達量才達到最大。水楊酸和茉莉酸均能誘導GhWRKY44基因的表達,水楊酸誘導后,GhWRKY44基因表達量迅速增加,且其表達量一直維持在一個較高水平;而茉莉酸誘導后,GhWRKY44基因表達量呈先增加后降低的變化趨勢,且其表達水平明顯低于水楊酸誘導。研究表明,GhWRKY44基因可能參與了棉花對病原菌和激素脅迫的應答反應。

關(guān)鍵詞:棉花;WRKY轉(zhuǎn)錄因子;枯萎病菌;基因克隆;表達分析

棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum,Fov)是由尖孢鐮刀菌(萎蔫?；?引起的一種土傳性真菌維管束病害,嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。培育抗病品種是解決棉花尤其是海島棉枯萎病危害最為經(jīng)濟有效的途徑。陸地棉中含有豐富的枯萎病抗性資源,利用基因工程技術(shù)從中挖掘抗病基因,將為海島棉抗枯萎病分子育種奠定基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與順式作用元件相結(jié)合,從而調(diào)控相關(guān)目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。大量研究表明,轉(zhuǎn)錄因子在植物與病原菌互作中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前已知與抗病反應有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有bZIP型、AP2/ERF家族、WRKY家族、MYB家族、Homeodomain蛋白、HSF蛋白等[1]。其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一,不僅參與植物的生長發(fā)育,而且在調(diào)控植物生物和非生物脅迫中起重要作用[2-4]。

第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子是1994年Ishiguro等[5]從白薯中克隆得到的,此后人們從多種植物中分離出多個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),該類基因家族都含有一段由60個氨基酸組成的高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域,其N末端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK,羧基C末端有鋅指結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)域可以與靶基因的順式作用元件W-box((T)TGAC(C/T))發(fā)生特異性結(jié)合,從而調(diào)節(jié)基因的表達,參與植物的生長和發(fā)育[8]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)類型,可將WRKY家族分為三類:第Ⅰ類包含2個WRKY結(jié)構(gòu)域,第Ⅱ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域,第Ⅰ、Ⅱ類鋅指結(jié)構(gòu)均為C2H2型(C-X4-5-C-x22-23-H-XI-H),第Ⅲ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域,鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)。近期研究表明,在擬南芥中,幾乎所有的第三類WRKY蛋白都與應答生物脅迫反應有關(guān)[9]。Tao等[10]研究發(fā)現(xiàn),水稻中過量表達OsWRKY45-1和OsWRKY45-2能提高水稻對稻瘟病的抗性;Dang等[11]研究發(fā)現(xiàn),過量表達CaWRKY40能提高辣椒對青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)侵染的抗性,但當該基因沉默后,對青枯雷爾氏菌侵染的抗性減弱。Higashi等[12]在擬南芥中發(fā)現(xiàn),過表達基因AtWRKY41提高了對假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性,但對軟腐病菌(Erwiniacarotovora)的抵抗力下降。目前,大多數(shù)與抗病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究主要在模式生物中進行,對棉花的WRKY轉(zhuǎn)錄因子了解還十分有限,WRKY轉(zhuǎn)錄因子是否在棉花抗枯萎病中發(fā)揮作用及其作用的分子機制還不清楚。石河子大學長絨棉育種課題組利用Solexa高通量測序技術(shù)建立了枯萎病菌誘導棉花幼苗根部不同時間的基因表達譜,本研究以此為基礎(chǔ),從中篩選并克隆了一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因,利用qPCR技術(shù)分析其在枯萎病菌和激素脅迫下的表達模式,為海島棉抗枯萎病品種的改良提供新的基因資源和理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實驗材料及其處理

1.1.1實驗材料高抗枯萎病陸地棉品種‘中棉所12’和高感枯萎病陸地棉品種‘新陸早7號’由石河子大學棉花所提供。選取硫酸脫絨后籽粒飽滿種子,0.1%氯化汞浸泡消毒15 min,無菌水沖洗4～5遍,種植于無菌蛭石,待棉苗長至3 cm左右時將其移入盛有霍格蘭營養(yǎng)液的發(fā)芽盒(棉苗用帶有孔洞的泡沫板漂浮),于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育,每周換2次培養(yǎng)液。

1.1.2枯萎病菌處理枯萎病菌落菌種為枯萎病7號生理小種的強致病力菌系F430,由石河子大學植保系張莉老師提供。接種到已滅菌的查氏培養(yǎng)液中,28 ℃震蕩培養(yǎng)4 d,配制成濃度為7×106/mL的孢子懸浮液。待棉苗第一片真葉完全展開時,選取生長一致的棉苗浸泡到孢子懸浮液中45 min后轉(zhuǎn)入霍格蘭營養(yǎng)液中[13],在侵染后的0、1、3、6、12、24和48 h分別采集‘中棉所12’和‘新陸早7號’的根部組織,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.1.3激素處理待棉苗的第一片真葉完全展開時,選取生長一致的棉苗分別浸于含有1 mmol/L乙烯(ET)、50 μmol/L水楊酸(SA)和1 mmol/L茉莉酸(JA)的霍格蘭營養(yǎng)液中。處理0、0.5、1、2、4、8、12和24 h后分別取植株的根部組織,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1GhWRKY44基因克隆用改良的CTAB法[14]提取材料的總RNA。cDNA的合成按照Takara公司生產(chǎn)的first strand cDNA synthesis kits說明書的步驟進行操作。

以表達譜中篩選到的WRKY基因片段為探針,在NCBI中棉花(Gossypiumhirsutum)EST數(shù)據(jù)庫進行Blastn比對,選擇下載與之一致性較高的ESTs序列,運用在線拼接軟件CAP3(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)進行ESTs序列拼接;以拼接的序列為新探針,繼續(xù)在棉花EST數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索,直到拼接的序列不再延伸為止。通過NCBI網(wǎng)站上ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Conserved Domain Search(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析開放閱讀框和保守域,選取ORF完整且含有WRKY結(jié)構(gòu)域的序列,利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物F1(GCTCTAGAATGGATGTGG-ATTGGGATTTGC和R1(CGAGCTCCCGGCGGTG-ACCGTTTGTGGAG)并擴增ORF。以枯萎病菌處理后的根系cDNA為模板,進行PCR擴增,擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收預期大小的目的片段與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH-5α大腸桿菌感受態(tài),通過質(zhì)粒PCR與酶切驗證,篩選陽性菌株送華大基因進行測序。

1.2.2序列分析利用Inter Pro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進行蛋白保守域分析;用DNAMAN進行序列比對分析;利用Mega 5.0進行進化分析。利用GOR4(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)進行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析;利用ExPaSy ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)進行蛋白親/疏水性分析;利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進行WRKY結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)的同源建模分析;利用ExPaSy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白理化性質(zhì)分析。

1.2.3實時熒光定量PCR分析利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計目的基因qRT-PCR引物F2(AGTTCTTTAATGGCGGATTT)和R2(GCTT-AGGCTTTACTTGTTGA),以GhUBQ7(DQ116441)為內(nèi)參基因,FU(GAAGACCTACACCAAGCCC-AAG)和RU(CGGACTCTACTCAATCCCCACC)為引物,由北京六合華大基因科技有限公司合成。實時熒光定量PCR反應體系及程序參見TOYOBO公司SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(QPK-212)說明書,實驗設(shè)3個重復,采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

2結(jié)果與分析

2.1GhWRKY44基因克隆及序列分析

2.1.1GhWRKY44克隆以在線拼接軟件CAP3進行ESTs序列的拼接,獲得一個ORF完整且含有WRKY結(jié)構(gòu)域的序列,依據(jù)這個序列的ORF設(shè)計PCR擴增引物,以枯萎病菌處理后的棉花根部cDNA為模板,擴增獲得一條長度為1 197 bp序列(圖1),測序結(jié)果表明,其核苷酸序列與電子克隆序列一致,經(jīng)Blast比對,該序列編碼398個氨基酸,所編碼的氨基酸中含有2個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域,分別位于第126～182和317～374氨基酸之間,屬于WRKY家族Ⅰ類,將該基因命名為GhWRKY44,登錄號為KJ801807。

2.1.2序列分析利用生物信息學網(wǎng)站對GhWRKY44基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域分析表明,該基因編碼的蛋白分子量為44.24 kD,理論等電點為8.80,為親水蛋白。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析表明,無規(guī)則卷曲所占比例為63.57%,是該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成元件,而α螺旋和延伸鏈所占比例分別為16.33%和20.10%。蛋白WRKY結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)分析表明,該轉(zhuǎn)錄因子的WRKY結(jié)構(gòu)域與AtWRKY4[15]非常相似(圖2),推測GhWRKY44基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子可能具有與AtWRKY4相類似的結(jié)合特性,即可以與下游基因啟動子中的W-box結(jié)合,從而實現(xiàn)對下游基因的表達調(diào)控。

圖1　GhWRKY44基因PCR擴增(A)和酶切驗證(B)

2.1.3GhWRKY44基因同源進化分析運用DNAMAN軟件對GhWRKY44基因預測的氨基酸序列與Genbank上公布的其他一些物種的WRKY基因(AtWRKY4:NP_172849;GhWRKY116:KF031118;CaWRKY2:ABA56495;GhWRKY18:KF031076;GhWRKY74:KF031105;AtWRKY20:NM_179119;OsWRKY30:HM153428;AtWRKY44:NM_129282.3)的氨基酸序列進行同源性比較,結(jié)果(圖3)表明,該基因預測的氨基酸序列與上述基因氨基酸序列的保守區(qū)主要集中在2個WRKY結(jié)構(gòu)域,且該基因含有預測的核定位信號序列(KRKK),其鋅指結(jié)構(gòu)為CX4～5CX22～23HX1H(X為任意氨基酸),與前人研究相符合。利用Mega 5.0軟件對GhWRKY44與上述基因進化關(guān)系比較,該基因在進化上與擬南芥AtWRKY44的親緣關(guān)系最近(圖4)。

2.2GhWRKY44的表達特性

由圖5可以看出,枯萎病菌誘導后,GhWRKY44基因的表達量在抗病品種中明顯增加,并隨處理時間的推移呈現(xiàn)先增加后降低再增加的變化趨勢,在處理后3 h表達量達到最大,是處理前的10.93倍,隨后逐漸下降,24 h后表達量再次增加;與抗病品種相比,GhWRKY44基因在感病品種中的表達水平明顯低于抗病品種,對病原菌響應時間也晚于抗病品種,處理后6 h表達量才達到最大,且只有處理前的2.94倍。由此推測,GhWRKY44基因可能與棉花枯萎病抗性有關(guān)。

通過qRT-PCR檢測GhWRKY44表達結(jié)果(圖6)表明,SA和JA均能夠誘導GhWRKY44基因的表達。SA處理后,該基因的表達量迅速增加,在處理后0.5 h已增至處理前的13.64倍,隨處理后時間的推移,其表達量一直維持在一個較高的水平,24h表達量達到最高,為處理前的26.91倍;JA處理后,該基因的表達量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,處理后4 h其表達量達到最高值,但其表達水平明顯低于SA處理,7個時間點的平均相對表達量只有SA處理的1/7。ET處理后,GhWRKY44基因的表達量變化不明顯。

圖2　GhWRKY44與AtWRKY4編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析

圖3　GhWRKY44推定的氨基酸序列與其他

圖4　GhWRKY44與其他WRKY

圖5　中棉所12和新路早7中GhWRKY44基因

圖6　不同激素處理后GhWRKY44基因表達模式

3討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有超級基因家族,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),擬南芥中有72個WRKY基因[16],水稻中有97個WRKY基因[17]。本研究以枯萎病菌誘導棉花根部基因表達譜中篩選得到WRKY基因片段為探針,通過電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù),從陸地棉中克隆到1個編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因,命名為GhWRKY44;該基因編碼的氨基酸序列含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu),同時存在1個預測的核定位信號序列,保守域和進化樹分析證明該基因?qū)儆诿藁╓RKY轉(zhuǎn)錄因子I類。

近年來,隨著大量WRKY基因被克隆,已證實植物WRKY基因的主要生物學功能之一在于調(diào)控植物抗病反應及其信號轉(zhuǎn)導途徑的建立[18]。本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了枯萎病菌誘導后GhWRKY44基因的表達模式,結(jié)果表明在枯萎病菌誘導后,該基因在抗病品種中的表達量顯著高于感病品種,其高峰期出現(xiàn)時間也早于感病品種,推測該基因表達量的高低可能在一定程度上影響了植株對枯萎病菌的抗性。Hwang等[19]研究發(fā)現(xiàn),用水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)侵染培養(yǎng)3周的水稻幼苗,利用半定量PCR技術(shù)分析表明,OsWRKY6表達量持續(xù)增高,在48 h達到最大,超表達OsWRKY6轉(zhuǎn)基因擬南芥植株可以增強對真菌的抗性,同時提高抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。Yu[20]通過半定量PCR技術(shù)對棉花GhWRKY15進行表達特異性分析表明,分別用枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)處理后,表達量均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢,但枯萎病菌處理后在3 d表達量最高,立枯絲核菌處理后5 d表達量最高,且超表達GhWRKY15轉(zhuǎn)基因煙草植株可以增強對真菌的抗性。結(jié)合本研究結(jié)果,GhWRKY44對于病原菌響應時間與上述研究結(jié)果不完全一致,一方面可能是由于取樣時間差異較大,另一方面可能是不同的WRKY對不同病原菌響應不同造成。

大量研究認為,水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)是植物抗病信號轉(zhuǎn)導途徑中重要的信號分子[21]。沈懷舜等[22]從水稻中克隆了一個含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域的基因OsWRKY30,研究表明該基因受SA、JA和病原菌等多種信號因子的誘導,與植物對逆境的應答密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,GhWRKY44能被SA和JA誘導,但對ET誘導響應不明顯,與JA相比,SA對該基因誘導響應更為強烈,7個時間點的平均相對表達量約為JA處理的7倍,推測該基因主要通過SA信號傳導途徑調(diào)控下游相關(guān)基因的表達來參與棉花對枯萎病菌的抗性反應。Shi[23]研究發(fā)現(xiàn),分別用外源激素SA和MeJA處理培養(yǎng)1周的棉花幼苗,其表達量分別在6和12 h達到最高,超表達GhWRKY39-1轉(zhuǎn)基因煙草植株可以增強對細菌和真菌的抗性,在病原菌侵染后,對參與JA途徑的PR4和SA途徑的PR1c的轉(zhuǎn)錄水平有顯著提高。在擬南芥中,WRKY70蛋白質(zhì)參與兩條抗性信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控,既通過激活SA介導的抗病信號轉(zhuǎn)導途徑,又抑制JA介導的抗病信號轉(zhuǎn)導途徑,從而調(diào)控擬南芥的抗病反應[21]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一,對生物和非生物脅迫均能產(chǎn)生相應應答,因此,克隆棉花GhWRKY44基因,并對其表達特性進行分析,將有助于揭示該基因在棉花與病原菌互作中的作用,并為改良棉花抗病性提供新的候選基因。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis ofGhWRKY44 in Cotton

ZHAO Zengqiang,HAN Zegang,LI Huihui,LI Xiaoling,ZHANG Xi,ZHANG Wei*

(College of Agronomy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

Abstract:In this study,the WRKY gene fragment from a digital expression profiling of cotton root tissues infected byFusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Fov) was used as a probe,a WRKY transcription factor gene was cloned from the roots of ‘Zhongmiansuo 12’ through theinsilicocloning and RT-PCR,named asGhWRKY44(Genebank:KJ801807).Sequence analysis showed that the ORF ofGhWRKY44 was 1 197 bp,encoding 398 amino acids.GhWRKY44 contained two conserved WRKY domains and one C2H2 zinc finger structure,and belonged to group I of cotton WRKY transcription factor.Phylogenetic analysis showed thatGhWRKY44 closed toAtWRKY44.TheGhWRKY44 expression was detected by Real-time Quantitative PCR(qRT-PCR) and the results showed thatGhWRKY44 gene was predominantly expressed in resistant variety.With the duration of the treatment of Fov,the expression ofGhWRKY44 increased firstly and decreased,then increased again.When the treatment time was over 3 hours,the level ofGhWRKY44 expression reached the maximum in the resistant variety.However,the relative expression ofGhWRKY44 was significantly lower and the response was later in the susceptible variety than that in resistant variety and the level ofGhWRKY44 expression reached the maximum when the treatment time was over 6 hours.Both salicylic acid and jasmonic acid could induce the expression ofGhWRKY44.After the treatment of salicylic acid,the level ofGhWRKY44 expression increased rapidly and maintained at a high level.However,the expression ofGhWRKY44 firstly increased and then decreased when induced by jasmonic acid.Compared with salicylic acid,the induced expression levels ofGhWRKY44 were significantly lower than that of under jasmonic acid.The results demonstrated thatGhWRKY44 may be response to pathogen and hormone stress in cotton.

Key words:cotton;WRKY transcription factors;Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum;gene clone;expression analysis

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

作者簡介:趙曾強(1985-),男,在讀碩士研究生,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:tlx4109@126.com*通信作者:張薇,博士,教授,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:zhw_agr@shzu.edu.cn

基金項目:國家自然基金(31260358);農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08005-005)

收稿日期:2014-9-15;修改稿收到日期:2014-12-09

文章編號:1000-4025(2015)01-0010-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0010