李潮，劉曉溪，付海燕，杜紅陽

脈絡(luò)膜黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成人最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤之一，在全球的發(fā)病率占眼內(nèi)惡性腫瘤的首位，在我國占第二位[1]。CM惡性程度高，轉(zhuǎn)移早且廣泛，如不經(jīng)治療，一般在出現(xiàn)癥狀后4～6個月內(nèi)死亡。CM最常用的兩種治療方法是眼球摘除和放射性敷貼治療[2]，其中以手術(shù)切除為首選。但大多數(shù)患者確診時已為中晚期，身體狀況較差，故尋求高效的抗腫瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)。本研究探討了雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)誘導(dǎo)人CM株OCM-1凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器 OCM-1(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)，胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，TPL(廣州藥業(yè)公司)，碘化丙錠(PI)、核糖核酸酶(RNase)、RPM I 1640培養(yǎng)基(法國賽墨菲公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗人caspase-3、β-actin、survivin、Bcl-2及Bax抗體(北京博奧森有限公司)，S-II倒置顯微鏡(日本O lympus公司)，流式細(xì)胞儀(FACScalibur，美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測TPL對OCM-1細(xì)胞增殖的影響

將TPL用二甲基亞砜(DMSO)配制成10mmol/L儲存液，DMSO終濃度＜0.01%(V/V)，–20℃貯存，實(shí)驗(yàn)前用PBS稀釋。收集對數(shù)生長期OCM-1細(xì)胞，置于10%胎牛血清中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個/m l，每孔180μl，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組于培養(yǎng)24h后加入20μl不同濃度的TPL，使其終濃度分別為5、10、20、40、80、160nmol/L，對照組加入等量的無血清RPM I 1640培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，分別作用24、48、72h。每孔加入20μl MTT(5mg/m l)作用4h，棄上清，加入150μl DMSO，振蕩溶解結(jié)晶后，以空白對照校正零點(diǎn)，在酶標(biāo)儀上測定不同濃度各孔在490nm波長處的吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=1–(實(shí)驗(yàn)組A值－空白對照A值)/(對照組A值－空白對照A值)×100%。分別計算不同濃度TPL對OCM-1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并繪制相應(yīng)的增殖抑制曲線。

1.2.2 瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取80nmol/L TPL作用OCM-1細(xì)胞48h，胰酶消化并收集細(xì)胞，1000r/m in離心3m in，制成細(xì)胞涂片，用瑞氏-吉姆薩染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測TPL誘導(dǎo)的OCM-1細(xì)胞凋亡

取20、40、80nmol/L TPL作用OCM-1細(xì)胞72h，5%胰酶消化后收集細(xì)胞，1000g/m in離心5m in，棄上清，冷PBS洗滌，加入70%冷乙醇4℃過夜，冷PBS洗滌，再次離心，加入10μg/m l RNase，37℃孵育30min，加入終濃度10μg/m l PI，輕輕混勻，避光反應(yīng)30min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.4 Western blotting檢測OCM-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 分別采用20、40、80nmol/L TPL誘導(dǎo)OCM-1細(xì)胞，24h后以RIPA裂解細(xì)胞，采用Low ry法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品在凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%奶粉封閉后，分別加入Bax抗體(1:300)、survivin抗體(1:300)、Bcl-2抗體(1:300)、caspase-3抗體(1:1000)及β-actin抗體(1:5000)，過夜；TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:3000)作用90m in。ECL法顯色，GIS凝膠圖像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，以對照組蛋白表達(dá)量為1，計算OCM-1細(xì)胞Bax、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TPL對OCM-1細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，TPL可抑制OCM-1細(xì)胞增殖，且呈時間劑量依賴關(guān)系(圖1)。OCM-1細(xì)胞經(jīng)TPL作用24、48、72h的IC50值分別為98.52、56.14、15.57nmol/L。

圖1 OCM-1細(xì)胞增殖曲線Fig.1 Proliferation curve of OCM-1 cells

2.2 瑞氏-吉姆薩染色觀察OCM-1細(xì)胞凋亡 在倒置顯微鏡下OCM-1細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、多角形等多種形態(tài)，核可為雙核或多核，呈圓形或橢圓形。隨TPL濃度增加及作用時間延長，細(xì)胞增殖逐漸受到抑制，細(xì)胞逐漸變圓，脫壁，接觸松散，胞質(zhì)中顆粒增大，細(xì)胞周圍出現(xiàn)碎片，部分細(xì)胞死亡后懸浮在培養(yǎng)液中，而空白對照組細(xì)胞貼壁生長，輪廓清楚，胞質(zhì)中無異常顆粒出現(xiàn)，增殖旺盛。80nmol/L TPL作用于OCM-1細(xì)胞48h后，瑞氏-吉姆薩染色光鏡觀察可見典型細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象(圖2)。

圖2 TPL對OCM-1細(xì)胞凋亡的影響(瑞氏-吉姆薩染色×200)Fig.2 OCM-1 cells apoptosis by TPL treatment (Wright-Giemsa's staining ×200)A. Control group；B. 80nmol/L TPL group

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測OCM-1細(xì)胞凋亡率 檢測結(jié)果顯示，隨TPL濃度增加，sub-G1百分比由對照組的0.46%±0.23%分別增至2.59%±3.79%(20nmol/L TPL)、18.43%±2.63%(40nm o l/L TPL)及24.62%±5.71%(80nmol/L TPL)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖3)。

2.4 Western blotting檢測OCM-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 經(jīng)20、40、80nmol/L TPL誘導(dǎo)后，OCM-1細(xì)胞Bc l-2蛋白表達(dá)量分別為89.32%±6.51%、68.30%±5.19%、57.23%±1.61%，survivin蛋白表達(dá)量分別為81.73%±3.67%、69.31%±2.28%、4 9.8 0%±6.1 1%，Ba x蛋白表達(dá)量分別為56.61%±4.21%、78.35±7.38%、87.21%±3.62%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。20nmol/L TPL作用OCM-1細(xì)胞未檢測到caspase-3蛋白活化，40nmol/L及80nmol/L作用后檢測到大小17kD的活性亞基(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測OCM-1細(xì)胞凋亡率Fig.3 The apoptosis rate of OCM-1 cells (FCM)A. Control group; B. 20nmol/L TPL group; C. 40nmol/L TPL group; D. 80nmol/L TPL group

圖4 Western blotting檢測OCM-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of apoptosis related protein in OCM-1cells(Western blotting)Bax/Bcl-2; B. Survivin; C. caspase-3; 1. Contro l group; 2.20nmol/L TPL; 3. 40nmol/L TPL; 4. 80nmol/L TPL

3 討 論

TPL是雷公藤的主要有效成分之一，其相關(guān)效價比雷公藤總甙高100～200倍，臨床上已廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)TPL具有廣泛且高效的抗腫瘤作用，對人白血病、淋巴瘤等60多種腫瘤細(xì)胞均具有很好的抑制作用[4-7]。TPL對黑色素瘤細(xì)胞同樣具有抑制作用，但有關(guān)TPL對CM的作用仍需進(jìn)一步研究。

Bcl-2蛋白家族以Bcl-2和Bax為代表，該家族成員可通過線粒體內(nèi)外膜上的蛋白間接或直接影響線粒體途徑凋亡的發(fā)生[8]。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)時，Bcl-2家族蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)線粒體中促凋亡因子的釋放。相關(guān)研究表明，Bax/Bcl-2比值決定了細(xì)胞對凋亡信號的反應(yīng)[9-10]。本研究中，不同濃度TPL作用于人CM株OCM-1 24h，可使Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，表明TPL誘導(dǎo)人CM細(xì)胞株OCM-1凋亡可能與調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2的表達(dá)水平有關(guān)。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族的抗凋亡蛋白，在人CM細(xì)胞株OCM-1中表達(dá)率較高，與人CM的發(fā)生、進(jìn)展以及原發(fā)性、繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生存在直接關(guān)聯(lián)[11]。Survivin可抑制caspases級聯(lián)激活，抑制細(xì)胞凋亡，其中對caspase-3的活化抑制最為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，TPL可使OCM-1細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，且呈濃度依賴性關(guān)系。

細(xì)胞凋亡主要通過死亡受體途徑和線粒體途徑，caspases家族為最終執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡過程中通過對骨架蛋白的剪切，引起細(xì)胞核固縮、碎裂等復(fù)雜的形態(tài)學(xué)變化，其中caspase-3是以上兩種途徑的共同交匯點(diǎn)，是caspase級聯(lián)反應(yīng)中的終末執(zhí)行分子[12-13]。研究證實(shí)，caspase-3的活性表達(dá)與細(xì)胞凋亡途徑關(guān)系密切[14]。本研究中20nmol/L TPL作用于OCM-1細(xì)胞后，檢測到的caspase-3為非活化狀態(tài)，但濃度升高至40nmol/L及80nmol/L時則可檢測到caspase-3的活性亞基，且隨著濃度升高，caspase-3活化增強(qiáng)，提示caspase-3可能參與了TPL誘導(dǎo)OCM-1細(xì)胞凋亡。caspase-3的活化受多方面因素的調(diào)控，本研究結(jié)果表明，TPL在誘導(dǎo)OCM-1細(xì)胞凋亡的過程中通過調(diào)節(jié)Bax與Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，影響線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、survivin等凋亡蛋白及凋亡抑制蛋白的釋放，其中凋亡抑制蛋白survivin表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)凋亡發(fā)生，導(dǎo)致caspase-3活化，促使凋亡相關(guān)事件的發(fā)生，從而間接證實(shí)了TPL在誘導(dǎo)OCM-1凋亡中的作用可能是通過線粒體凋亡途徑所引發(fā)。

總之，凋亡途徑異常復(fù)雜，凋亡與否取決于促凋亡蛋白及相關(guān)凋亡蛋白的動態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TPL可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白與促凋亡蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)OCM-1細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

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