蘇英鋒，孫秀珍，劉迎曦，閆志勇，沈雙，辛?xí)匝?，?申

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉科，遼寧 大連116027;2.大連理工大學(xué) 工業(yè)裝備結(jié)構(gòu)分析國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116024)

近年來(lái)，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾患者發(fā)病率逐漸增高。耳蝸——執(zhí)行感音功能的核心結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)將聲音由機(jī)械能轉(zhuǎn)換為電能，進(jìn)一步經(jīng)聽神經(jīng)傳導(dǎo)入大腦，從而引起聽覺(jué)。目前針對(duì)感音功能的研究手段主要包括:(1)功能測(cè)試如電測(cè)聽、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、腦干聽覺(jué)誘發(fā)電位等;(2)形態(tài)學(xué)觀察如掃描電鏡和投射電鏡觀察等。然而上述研究措施已然難以適應(yīng)現(xiàn)代耳科學(xué)研究的需要。鑒于耳傳聲與感音過(guò)程力學(xué)特征顯著，運(yùn)用生物力學(xué)方法對(duì)耳傳聲與感音功能進(jìn)行研究逐漸得到了醫(yī)、理學(xué)科研究人員的重視，此外，該方法還有助于定性、定位、定量描述器官結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系［1］。因此，耳生物力學(xué)研究已經(jīng)成為一個(gè)快速發(fā)展的新興研究領(lǐng)域［2］。

關(guān)于耳蝸力學(xué)研究:早期的耳蝸數(shù)值模型假設(shè)耳蝸淋巴液為無(wú)粘滯性的理想流體，同時(shí)將Navier-Stokes 方程簡(jiǎn)化為線性方程，所建模型過(guò)于簡(jiǎn)化，與正常生理狀態(tài)下的耳蝸有較大差別［3］;近年來(lái)，研究人員進(jìn)一步建立了耳蝸三維數(shù)值模型，其所建模型將簡(jiǎn)化為直管狀，其中的基底膜簡(jiǎn)化為直板形［4-6］;楊國(guó)標(biāo)等［7］進(jìn)一步基于micro -CT 建立了三維螺旋管形耳蝸模型，符合正常生理狀態(tài)下耳蝸呈螺旋狀結(jié)構(gòu)的特性。

耳蝸位置深在、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影像學(xué)掃描不能很好地顯示其膜性結(jié)構(gòu)，使得上述所建模型不能完全反映耳蝸膜迷路的結(jié)構(gòu)特征，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)連續(xù)組織切片技術(shù)獲取耳蝸膜迷路結(jié)構(gòu)的二維解剖數(shù)據(jù)，進(jìn)一步建立豚鼠耳蝸宏觀生物數(shù)值模型，并模擬耳蝸基底膜感音過(guò)程，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

健康成年豚鼠1 只，體重500 g，雄性，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。耳廓反射靈敏，耳內(nèi)鏡檢查未見異常，聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射、腦干聽覺(jué)誘發(fā)電位檢查均無(wú)異常。

計(jì)算機(jī)軟件:Photoshop 圖像處理軟件、Mimics和Hypermesh 軟件、有限元分析軟件ANSYS12. 0等。

1.2 方 法

1.2.1 制作豚鼠內(nèi)耳連續(xù)組織切片:選擇健康成年豚鼠1 只，運(yùn)用10%水合氯醛2 mL 腹腔注射，麻醉后迅速斷頭，取出顳骨聽泡并予以修剪，保留豚鼠耳蝸及前庭部分，用針尖在蝸尖骨壁鉆孔，再挑開蝸窗下緣骨壁，用4%多聚甲醛進(jìn)行蝸管內(nèi)灌流，將內(nèi)、外淋巴液充分灌流出去，同時(shí)固定膜迷路，然后迅速將組織塊浸泡于4%多聚甲醛中固定48 h。然后，依次經(jīng)過(guò)修剪、脫鈣;清洗、脫水;透明、浸蠟;定位、包埋;塑型、切片;HE 染色，其中選擇外定位法進(jìn)行定位，最終制作一套完整的豚鼠內(nèi)耳組織連續(xù)切片，切片厚度6 μm。

1.2.2 攝像并獲取二維結(jié)構(gòu)信息:采用帶微距鏡頭單反數(shù)碼相機(jī)(CANON EOS 7D MARK II)對(duì)豚鼠內(nèi)耳組織切片進(jìn)行攝像，相機(jī)設(shè)定為2020 萬(wàn)像素和最高圖像精細(xì)度，采用jpg 格式保存彩色圖像，將圖像文件傳送至計(jì)算機(jī)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成bmp 格式圖像，依次進(jìn)行編號(hào)。

1.2. 3 耳蝸膜迷路和基底膜的三維重建:運(yùn)用Adobe Photoshop 軟件將上述圖像轉(zhuǎn)換成黑白色圖片，然后進(jìn)行識(shí)別、標(biāo)記并強(qiáng)調(diào)邊界，以增強(qiáng)對(duì)比度，利于識(shí)別內(nèi)耳膜性結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)所獲豚鼠內(nèi)耳組織切片共480 張，為減少工作量，每3 張連續(xù)圖片選擇1 張進(jìn)行數(shù)字化，進(jìn)而三維重建，即所用圖像間隔為12 μm。選擇一張質(zhì)量最好的切片作為定位基準(zhǔn)，標(biāo)記其4 個(gè)定位點(diǎn)的坐標(biāo)，將其他圖像定位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，以定位基準(zhǔn)圖片為標(biāo)準(zhǔn)利用自由變換工具進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、移動(dòng)等將所有三維重建圖片定位點(diǎn)進(jìn)行擬合。

將上述圖片導(dǎo)入Mimics10.01 軟件，識(shí)別內(nèi)耳膜性結(jié)構(gòu)和基底膜邊界并形成邊界點(diǎn)坐標(biāo)。

運(yùn)用Hypermesh 軟件形成豚鼠內(nèi)耳膜性結(jié)構(gòu)和基底膜的邊界的幾何面。

將所獲取的幾何面導(dǎo)入到有限元軟件ANSYS12.0，進(jìn)一步生成豚鼠內(nèi)耳膜性結(jié)構(gòu)的三維幾何模型，采用Solid45 單元進(jìn)一步完整有限元剖分。

1.2.4 基于豚鼠耳蝸宏觀生物數(shù)值模型的基底膜模態(tài)分析:為了確定所建模型基底膜振動(dòng)特性，確定基底膜材料屬性:楊氏彈性模量:E=2.0 ×105Pa，泊松比0. 3，密度為1200 kg/m3阻尼D = 10-6kg/m［8］;邊界條件:基底膜的兩側(cè)面及蝸?lái)敹耸┘庸潭ㄎ灰萍s束，運(yùn)用Block Lanczos 解法求解，得到模型前10 階固有頻率和振型，即模態(tài)分析。其中基底膜幾何尺寸:蝸底直徑為0.41 ×10-4m，蝸?lái)斨睆綖?.75 ×10-4m，長(zhǎng)度為1.40 ×10-2m，蝸底至蝸?lái)敽穸戎饾u增寬3 倍［11］。

2 結(jié) 果

2.1 建立豚鼠耳蝸宏觀生物數(shù)值模型

通過(guò)組織連續(xù)石蠟切片及攝像，能夠獲得一整套豚鼠耳蝸連續(xù)切片的圖像;所建豚鼠耳蝸的宏觀三維生物數(shù)值模型能夠清楚顯示耳蝸的空間結(jié)構(gòu)特性，耳蝸呈螺旋型，共4 周，其內(nèi)基底膜亦呈螺旋狀曲面上升，基底膜寬度不同，其中近蝸底部為0.41 ×10-4m，近蝸?lái)敳繛?. 75 ×10-4m，基底膜長(zhǎng)度為1.40 ×10-2m。見圖1。

圖1 豚鼠耳蝸(A)基底膜(B)三維生物模型示意圖Fig 1 3 - D Biological model of cochlea(A)and basilar membrane(B)

2.2 模態(tài)分析結(jié)果

聲波信號(hào)傳導(dǎo)入內(nèi)耳后，基底膜振動(dòng)具有頻率特異性，其中低頻聲音激勵(lì)下，最大行波振幅靠近基底膜耳蝸?lái)敳?，而在高頻聲音激勵(lì)時(shí)，最大行波振幅則靠近基底膜底部，本實(shí)驗(yàn)分析頻率階次共10 階，從1 階依次到10 階對(duì)應(yīng)的最大行波振幅頻率分別為2919.7 Hz、4409. 3 Hz、4946. 3 Hz、5650. 8 Hz、5910. 2 Hz、6575. 1 Hz、7134. 0 Hz、7359. 3 Hz、7858.6 Hz、8247.5 Hz。具體見圖2。

3 討 論

3.1 基于耳蝸二維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)建立三維模型的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

圖2 耳蝸基底膜模態(tài)分析基底膜振型云圖(Ⅰ- Ⅹ階)Fig 2 Cloud picture of modal shape of the basilar membrane(Ⅰ- Ⅹ)

制備能夠滿足生物力學(xué)模型構(gòu)建所需要的二維組織切片的精度要求不同于常規(guī)實(shí)驗(yàn)要求，不僅要求結(jié)構(gòu)保留完整，而且要求結(jié)構(gòu)不能移位，否則所建模型便會(huì)失真。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中投入了大量的人力和物力保證二維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)中耳蝸固定主要通過(guò)蝸尖注入4%多聚甲醛灌洗，其過(guò)程首先需要探針手工方法挑開蝸尖，會(huì)不同程度地?fù)p傷蝸尖相關(guān)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致二維組織切片中靠近蝸?lái)數(shù)哪ば越M織移位、失真，使得在三維重建過(guò)程中需要耳科醫(yī)生根據(jù)解剖學(xué)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)予以修復(fù)。李寒等［9］提出心臟灌注能夠滿足耳蝸膜性結(jié)構(gòu)固定的需要，而且可以避免結(jié)構(gòu)的損傷，值得借鑒。

基于組織連續(xù)切片技術(shù)進(jìn)行耳蝸三維重建的一個(gè)難點(diǎn)是定位，定位點(diǎn)的精度直接影響了三維重建結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和精確性。目前的定位方法主要包括:(1)利用鋼針穿刺或激光打孔;(2)根據(jù)解剖學(xué)的相關(guān)知識(shí)進(jìn)行辨別;(3)將標(biāo)本的側(cè)面修成平面［10］。本實(shí)驗(yàn)前期多次試制過(guò)程中發(fā)現(xiàn)外定位法相對(duì)穩(wěn)定可行，遂采用植物桿莖作為定位物，包埋時(shí)不僅能夠與石蠟緊密結(jié)合，而且不易移位，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)切片4 個(gè)定位點(diǎn)全部在位，少數(shù)切片有定位點(diǎn)脫落現(xiàn)象，但每張切片最少有2 個(gè)定位點(diǎn)，決定了后續(xù)三維重建過(guò)程的順利進(jìn)行。

石蠟組織切片具有制作方法簡(jiǎn)單、制備周期短、費(fèi)用低廉、切片形態(tài)結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)［11］，能夠滿足宏觀耳蝸生物模型的要求，但其切片厚度僅為4 ～6 μm，在展片的過(guò)程中易于發(fā)生組織的變形、扭曲及損壞，需要謹(jǐn)慎操作。盡管如此，仍然有部分切片不能達(dá)到要求，如切片染色不均、切片中混有雜質(zhì)、部分結(jié)構(gòu)缺失等，因此在配準(zhǔn)以前仍然需要進(jìn)一步處理，確保切片清晰，具體包括:(1)切片的過(guò)程中采用光鏡進(jìn)行觀察，剔除結(jié)構(gòu)有破壞的殘片或廢片;(2)切片完成后手工去除周邊雜質(zhì)或組織殘端;(3)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將彩色圖像轉(zhuǎn)變?yōu)榛叶葓D像，并調(diào)整比例大?。?2-13］。

本實(shí)驗(yàn)最終所建模型清晰地顯示了豚鼠耳蝸的空間結(jié)構(gòu)特征，與Gan RZ 等［14-15］耳蝸重建結(jié)果一致?？梢?，基于組織連續(xù)切片技術(shù)建立耳蝸生物力學(xué)模型的方法可行，甚至可推廣應(yīng)用于其他小微器官生物數(shù)值模型的建立。

3.2 耳蝸基底膜生物數(shù)值模型的建立

本實(shí)驗(yàn)所建基底膜生物力學(xué)模型的結(jié)構(gòu)特征為從蝸軸底部到蝸軸頂部呈螺旋狀上升，基底膜呈上寬下窄，靠近底周最窄，靠近耳蝸?lái)敳孔顚挘瑢挾确謩e為0.41 ×10-4m、2.75 ×10-4m，蝸底至蝸?lái)敽穸戎饾u增寬3 倍，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［15］。

模態(tài)分析可見振型特點(diǎn):耳蝸基底膜的前10 階固有頻率介于2919.7 ～8247.5 Hz 之間，固有頻率隨階次增加亦逐漸增加;第1 階模態(tài)中，最大振幅發(fā)生于基底膜靠近蝸?lái)斕?，隨階次增加，最大振幅位置逐漸向基底膜蝸底部移動(dòng)，與經(jīng)典行波學(xué)結(jié)論基本吻合。楊國(guó)標(biāo)等［7］基于數(shù)學(xué)方法分析結(jié)論一致，均與經(jīng)典“行波學(xué)說(shuō)”吻合，不同點(diǎn)在于其前10 階固有頻率在139.0 ～564.6 Hz，與本實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果不一致。分析主要原因在于其將基底膜簡(jiǎn)化直板狀，其“上底為0.05 mm，下底為5 mm，厚度為0.05 mm”，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶挾葹?0-4m 數(shù)量級(jí)，相差近100倍;此外，兩個(gè)模型均為簡(jiǎn)化基底膜模型，忽略了耳蝸Corti 器及淋巴液對(duì)基底膜的影響，亦是兩者差別的原因所在;另外基底膜的梯度、坡度及傾斜角度等因素對(duì)基底膜的行波及位移具有重要影響。上述均提示本課題組仍然需要進(jìn)一步建立更為精準(zhǔn)的生物力學(xué)模型。

總之，本實(shí)驗(yàn)基于連續(xù)組織切片技術(shù)獲得的耳蝸二維解剖數(shù)據(jù)建立三維有限元數(shù)值模型的技術(shù)路線可行，數(shù)值模擬結(jié)果與經(jīng)典的行波學(xué)說(shuō)基本吻合，為本課題組后續(xù)運(yùn)用生物力學(xué)方法對(duì)耳蝸感音功能進(jìn)行探索研究奠定了基礎(chǔ)。

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