郭淑娟，王琮民

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 老年病科，河北 邯鄲056001;2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲056001)

腦卒中一般分為缺血性和出血性兩種，缺血性腦卒中約占75%，是致殘和致死率高、治療難的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是由于缺血缺氧誘發(fā)的興奮氨基酸毒性的釋放和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使肌體清除氧自由基(ROS)能力下降，氧自由基大量增加最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷［1］。因此，及早阻斷或清除多余的ROS 可以減輕缺血后腦損傷。

普拉克索(PPX)分S-PPX 和R+PPX 兩種異構(gòu)體，兩者都有抑制ROS 產(chǎn)生的作用，屬于線粒體靶向抗氧化劑，前者是治療帕金森病的常用藥，后者和多巴胺D2/D3 受體親和性極低，一般不會(huì)產(chǎn)生多巴胺能不良反應(yīng)［2］。已有報(bào)道指出，R+PPX 可抑制肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的發(fā)展［3］，但其對(duì)缺血腦卒中損傷的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用線栓法制作中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，通過(guò)腹腔注射R+PPX，觀察其在不同時(shí)間對(duì)各組腦梗死體積變化及大鼠腦中ROS 數(shù)量影響，為臨床治療缺血腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑:大鼠呼吸機(jī)(美國(guó)CWE公司)、DGD-300S 電腦雙極電凝器(功率自動(dòng)補(bǔ)償型，銘志誠(chéng)醫(yī)療公司)、TDA -8301H 溫度顯示調(diào)節(jié)儀、透射電鏡(Olympus 公司)、BH-2 顯微鏡(日本Phillip 公司)、TTC(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)、R+PPX(天津大學(xué)科威公司)、新型熒光探針H2DCF-DA(Sigma 公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備:成年雄性健康大鼠60 只，體重250 ～300 g，購(gòu)于天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，清潔級(jí)，并在河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)備齊全，實(shí)驗(yàn)條件良好。采用抽簽方法將60 只健康雄性大鼠均分為3 組:假手術(shù)(sham)組，中動(dòng)脈栓塞(MCAO)組和R +PPX 注射中動(dòng)脈栓塞(R +PPX +MCAO)組，每組20 只。再灌注分為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，8 h 和24 h，每次10 只。R+PPX+MCAO 組于MCAO 前30 min 腹腔注射R+PPX(1 mg/kg)，sham 和MCAO 組注射等量的生理鹽水。

大鼠用10%水合氯醛過(guò)量麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，逐層分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，頸外動(dòng)脈(ECA)。用動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)CCA 和ICA，在ECA 上剪一小口，注入肝素鈉生理鹽水，將準(zhǔn)備好的尼龍栓線插入ECA，用手術(shù)線輕輕結(jié)扎，松開(kāi)ICA 的動(dòng)脈夾，尼龍線順勢(shì)插入ICA，至ICA 和ECA 交叉處，然后調(diào)整插入栓線角度，要保證栓線的頭部進(jìn)入ICA，然后緩慢向ICA 入顱方向移動(dòng)栓線約18 mm 至大腦前動(dòng)脈起始處，阻斷大腦中動(dòng)脈血液供應(yīng)，MCAO 建模成功，記錄MCAO時(shí)間，將栓線扎緊，移去CCA 動(dòng)脈夾，并且縫合各層的皮膚組織，栓線應(yīng)在切口外留2 cm，MCAO 2 h時(shí)，將栓線輕輕拉出，線栓頭端退回ECA 處，再灌注完成。手術(shù)完畢可用慶大霉素注射液沖洗傷口，手術(shù)過(guò)程規(guī)范、無(wú)菌，此過(guò)程大鼠體溫保持在(37 ±0.5)℃，心率和動(dòng)脈壓保持在正常范圍內(nèi)。

1.2 方 法

1.2.1 腦梗死體積計(jì)算［4］:缺血再灌注8 h 或24 h大鼠用水合氯醛(10%)過(guò)量麻醉，斷頭取腦，在-24 ℃冰箱中冷凍全腦30 min，從額極至枕極把大腦切成2 mm 厚度的冠狀切片5 個(gè)層面，將切片置于2%TTC 染色液中，在37 ℃條件下，避光孵育20 min，將5 個(gè)切片順序擺放在藍(lán)色背景平板上，拍照，計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=梗死體積÷全腦體積×100%。

1.2.2 H2DCF-DA 染色分析［5］:將TTC 染色后制作的腦組織冷凍切片各取第4 片連續(xù)冷凍再切片，切為20 μm 10 片，利用H2DCF -DA 進(jìn)行染色，檢測(cè)ROS 陽(yáng)性表達(dá)，用專業(yè)圖像分析軟件NIS Element確定半暗帶區(qū)H2DCF-DA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度平均值=總熒光強(qiáng)度值/H2DCF -DA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3 組大鼠MCAO 建模過(guò)程的生理指標(biāo)檢測(cè)值

建立大鼠中動(dòng)脈栓塞模型過(guò)程中，3 組大鼠的心率、動(dòng)脈壓和肛溫差異經(jīng)單因素方差分析差異無(wú)顯著性意義(P ＞0.05)，可以忽略手術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。見(jiàn)表1。

表1 3 組大鼠在MCAO 建模過(guò)程的生理指標(biāo)檢測(cè)值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

表1 3 組大鼠在MCAO 建模過(guò)程的生理指標(biāo)檢測(cè)值Tab 1 The physiological parameters of three groups at different time (±s)

組別 心率(次/min) 動(dòng)脈壓(mmHg) 肛溫(℃)sham 組340.73 ±10.07 99.76 ±10.53 37.09 ±0.33 MCAO 組 345.04 ±9.45 99.34 ±9.96 36.85 ±0.53 R+PPX+MCAO 組342.72 ±11.31 98.93 ±10.02 36.95 ±0.34

2.2 3 組大鼠腦梗死體積比較

再灌注后8 h 和24 h，MCAO、R +PPX +MCAO兩組與sham 組相比較，梗死體積明顯增大(P ＜0.05)，再灌注后8 h，R +PPX +MCAO 組的梗死體積明顯小于MCAO 組(P ＜0.05)，再灌注后24 h，MCAO、R+PPX +MCAO 兩組的腦梗死體積無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，且MCAO、R +PPX +MCAO 兩組的腦梗死體積均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。見(jiàn)表2。不同時(shí)間腦梗死情況見(jiàn)圖1。

表2 3 組大鼠在不同時(shí)間腦梗死體積百分比Tab 2 The infract volume of three groups at different time(%)

圖1 不同時(shí)間腦梗死體積Fig 1 The infract volume at different time

2.3 H2DCF-DA 監(jiān)測(cè)大鼠腦內(nèi)ROS 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和熒光染色結(jié)果分析

熒光染色sham 組大鼠沒(méi)有出現(xiàn)腦梗死，圖像顯示未出現(xiàn)缺血半暗帶，無(wú)H2DCF - DA 染色。MCAO、R+PPX +MCAO 兩組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的半暗帶區(qū)均出現(xiàn)H2DCF -DA 染色細(xì)胞，BH -2 顯微鏡下胞體為綠色，可清晰看到凸起，再灌注8 h 時(shí)，H2DCF-DA 染色細(xì)胞R +PPX +MCAO 組明顯低于MCAO 組(P ＜0.05)，熒光色也較弱，但24 h 時(shí)，兩組的H2DCF -DA 染色細(xì)胞數(shù)、熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。見(jiàn)圖2，表3、4。

表3 3 組大鼠在不同時(shí)間ROS 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Tab 3 ROS(+)cell numbers of three groups

表4 3 組大鼠在不同時(shí)間熒光強(qiáng)度Tab 4 Fluorescence intensity of three groups

3 討 論

腦卒中時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一些可以清除自由基的酶，這些酶可以對(duì)腦缺血損傷起到保護(hù)作用［6］。故增加體內(nèi)的抗氧化劑可以抑制ROS 的產(chǎn)生從而保護(hù)腦組織。R(+)普拉克索(R +PPX)是普拉克索兩種異構(gòu)體其中之一，具有抗氧化作用，可以抑制線粒體ROS 的產(chǎn)生，而且與多巴胺D2/D3 受體具有較低的親和性，可以避免體內(nèi)的多巴胺能不良反應(yīng)。已有報(bào)道指出，R+PPX 可以抑制肌萎縮側(cè)索硬化，可使肌萎縮側(cè)索硬化大鼠模型的生命延長(zhǎng)［7］。R +PPX 容易突破血腦脊液屏障，其在腦中的濃度比其在血漿中的濃度高出5 倍［8］。本實(shí)驗(yàn)采用建模前30 min 給大鼠腹腔注射R +PPX 的方法觀察其效果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，缺血再灌注8 h 時(shí)，R+PPX 干預(yù)組的腦梗死體積明顯小于未干預(yù)組，血再灌注24 h時(shí)，R+PPX 干預(yù)組的腦梗死體積和未干預(yù)組的腦梗死體積差異不大，說(shuō)明一次性注射R +PPX 對(duì)腦缺血損傷有保護(hù)作用，但保護(hù)作用持續(xù)時(shí)間短。

圖2 不同時(shí)間熒光染色結(jié)果Fig 2 H2DCF-DA fluorescence staining results at different time

本實(shí)驗(yàn)采用H2DCF -DA 熒光法測(cè)定ROS，用專業(yè)圖像分析軟件NIS Element 確定半暗帶區(qū)H2DCF-DA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，缺血再灌注8 h 時(shí)，R + PPX 干預(yù)組的H2DCF-DA 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度明顯低于未干預(yù)組，說(shuō)明R +PPX 可以抑制腦缺血后腦組織內(nèi)ROS 的生成，且ROS 和腦梗死體積降低的時(shí)間點(diǎn)同步，這一結(jié)果提示R + PPX 可能是通過(guò)清除ROS 而起到對(duì)缺血腦組織的保護(hù)作用的。再灌注24 h 時(shí)，R+PPX 干預(yù)組和未干預(yù)組的H2DCF-DA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度差異不大，說(shuō)明R +PPX 清除ROS 的時(shí)效性不強(qiáng)，這可能與用藥的劑量、頻率有關(guān)系，故以后可以觀察不同劑量和多次用藥時(shí)R+PPX 對(duì)缺血腦損傷的保護(hù)作用。

［1］ 霍世會(huì)，鄭大勇.出血和缺血性腦卒中患者危險(xiǎn)因素比較［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015，35(08):2043 -2045.

［2］ Tinazzi M，Vesco CD，F(xiàn)incati E，et al.Pain and motor complications in Parkinson＇s disease［J］. J Neurol Neurosurg Psych，2009，77(2):822 -825.

［3］ O＇Sullivan SS，Williams DR，Gallagher DA，et al.Nonmotor symptoms as presenting complaints in Parkinson＇s disease:a clinicopathological study［J］. Movement Disorders，2008，23(1):101 -106.

［4］ Kalbe E，Calabrese P，Kohn N，et al.Screening for cogni -tive deficits in Parkinson ＇s disease with the Parkin sonneuro- psychometric dementia assessment (PANDA)instrument［J］. Parkin Related Disorders，2010，9(1):50 -58.

［5］ Izunmi Y，Sawada H，Yamamoto N，et al.Novel neuroprotectived mechanisms of pramipexole，an anti-Parkinson drug，against endogenous dopamine-mediated excitotoxicity［J］.Eur J Pharmacol，2013，63(8):765 -771.

［6］ 司霞，陳月，李英，等.普拉克索添加治療帕金森病的療效和安全性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)［J］. 中國(guó)藥房，2013，2(44):896 -899.

［7］ 李永順.帕金森病患者予普拉克索治療的臨床效果觀察［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013，4(5):208 -212.

［8］ Walsh SR，Tang TY，Kullar P，et al.Ischaemic preconditioning during cardiac surgery:systematic review and meta -analysis of perioperative outcomes in randomised clinical trials［J］. Eur J Cardio Thora Surg，2012，45(3):1031 -1041.