李亞男, 孫黔云, 路青瑜

(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥理與活性篩選中心, 貴州 貴陽 550002)

原矛頭蝮蛇毒及其組分對(duì)凝血功能的影響

李亞男, 孫黔云, 路青瑜

(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥理與活性篩選中心, 貴州 貴陽 550002)

目的 研究原矛頭蝮蛇毒(PMV)及其組分作用于血液循環(huán)系統(tǒng)的部分生物學(xué)活性，進(jìn)一步探討其毒性機(jī)制。方法 采用Sephadex G-75凝膠層析方法分離不同分子質(zhì)量范圍的蛋白組分FⅠ, FⅡ和FⅢ。貧血小板血漿調(diào)節(jié)富血小板血漿使血小板為3×1011L-1，血小板懸液分別與PMV, FⅠ, FⅡ和FⅢ 0.03 g·L-1預(yù)孵育5 min，血小板聚集儀測(cè)定PMV及其組分誘導(dǎo)血小板聚集活性；PMV, FⅠ, FⅡ和FⅢ 0.05 g·L-1分別與纖溶酶原0.1 U·L-1預(yù)孵育10 min，采用單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定PMV及其組分酶切發(fā)色底物S-2251的作用；將大鼠血漿與PMV, FⅠ, FⅡ和FⅢ 1.0 g·L-1分別孵育5和30 min，測(cè)定凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和纖維蛋白原(FIB)水平；PMV, FⅠ, FⅡ和FⅢ 10, 50和250 mg·L-1處理微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活；PMV, FⅠ, FⅡ和FⅢ 0.1 g·L-1與含卵磷脂和不含卵磷脂的豚鼠紅細(xì)胞懸液分別孵育不同時(shí)間，計(jì)算溶血率。結(jié)果 與對(duì)照組相比，PMV和高分子質(zhì)量蛋白組分FⅠ(>71 ku)誘導(dǎo)血小板聚集率顯著升高〔(61.0±5.8)%和(56.9±5.9)%vs(12.4±4.1)%〕(P<0.01)。酶切發(fā)色底物S-2251結(jié)果顯示，PMV與中分子質(zhì)量組分FⅡ(18～37 ku)具有酶切發(fā)色底物的作用(P<0.01)。PMV和FⅠ可引起血漿凝固。與對(duì)照組相比，F(xiàn)Ⅱ組分和低分子質(zhì)量蛋白組分FⅢ(<10 ku)明顯使TT, APTT和PT的時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.01)。PMV, FⅠ及FⅡ?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞解離懸浮，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率下降，分別為(56.8±3.6)%，(71.6±3.8)%和(58.2±5.5)%。在無卵磷脂條件下，PMV和FⅡ可緩慢地引起紅細(xì)胞輕度溶血；在卵磷脂參與下，PMV和FⅡ引起豚鼠紅細(xì)胞急劇溶血，與正常對(duì)照組相比，在0.5 min內(nèi)溶血率從(17.7±1.0)%分別升高至(81.0±4.0)%和(81.0±1.0)%(P<0.01)。結(jié)論 PMV在體外表現(xiàn)出多方面的血循毒性質(zhì)的活性，不同分子質(zhì)量蛋白組分活性機(jī)制及作用不同。

原矛頭蝮蛇毒; 溶血; 抗凝; 血小板聚集

蛇毒是高度復(fù)雜的天然毒蛋白混合物，其中蝰科和蝮科蛇毒屬于血循毒，主要表現(xiàn)為損害血液循環(huán)系統(tǒng)的功能。原矛頭蝮蛇(Protobothropsmucrosquamatus)主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南和臺(tái)灣地區(qū)，又名烙鐵頭蛇，屬蝰蛇科原矛頭蝮屬。目前對(duì)原矛頭蝮蛇毒(Protobothropsmucrosquamatusvenom, PMV)的研究主要是蛇傷后臨床表征的收集，根據(jù)臨床表象推測(cè)PMV破壞凝血功能，但并不清楚PMV對(duì)血液循環(huán)系統(tǒng)的具體作用。PMV的臨床蛇傷表現(xiàn)主要為皮下出血、血尿、全身內(nèi)臟出血甚至失血性休克[1]。前期研究表明，PMV在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的血循毒作用[2]。本研究通過觀察血小板聚集、酶切活性、溶血活性、凝血指標(biāo)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的變化, 探討PMV及其不同分子質(zhì)量范圍蛋白組分在體外影響血液循環(huán)系統(tǒng)部分功能的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器3只雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量250～270 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-2005；2只雄性體質(zhì)量2.0～2.5 kg健康大白兔以及1只體質(zhì)量330 g的雄性豚鼠均購(gòu)自貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(黔)2012-001。動(dòng)物福利及實(shí)驗(yàn)均符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。PMV凍干粉購(gòu)自湖南省沅陵縣徐氏蛇場(chǎng)；蛋白質(zhì)分離介質(zhì)Sephadex G-75凝膠和凝膠過濾分子質(zhì)量測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為大連寶生物公司產(chǎn)品；電泳試劑均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；凝血酶時(shí)間(thrombin time, TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time, APTT)和纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)測(cè)定的試劑盒均購(gòu)自上海太陽生物技術(shù)有限公司；發(fā)色底物S-2251為意大利Chromogenix公司產(chǎn)品；MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；卵磷脂為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；其他試劑均符合實(shí)驗(yàn)要求。AKTA Prime蛋白層析系統(tǒng)及Gene Quant紫外分光光度計(jì)，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司；Spectra MAX-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；血小板聚集儀(LBY-NJ4)，北京普利生儀器有限公司；5810R冷凍離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf公司；DYY-8C電泳儀及DYCZ-24D電泳槽，北京市六一儀器廠；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；Nikon TSl00倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；Milli Q超純水系統(tǒng)和Elix純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 PMV和蛋白組分的制備取PMV凍干粉1 mg，用1 mL PBS溶解，800×g離心10 min，取上清，為PMV溶液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?.5 g PMV凍干粉溶于3 mL PBS中，溶解后800×g離心10 min，取上清上樣于用PBS平衡好的Sephadex G-75凝膠層析柱(2.6 cm×95 cm)，制備不同分子質(zhì)量范圍蛋白組分。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組分280 nm吸光度值(A280 nm)，A280 nm值為1.0定為蛋白質(zhì)含量為1 g·L-1。采用凝膠過濾測(cè)定蛋白分子質(zhì)量方法，利用Sephadex G-75凝膠在AKTA Prime蛋白層析系統(tǒng)上精確測(cè)定完成，通過白蛋白(67.0 ku)、卵清蛋白 (43.0 ku)、胰凝乳蛋白酶原(25.0 ku)和核糖核酸酶(13.7 ku)求出蛋白分子質(zhì)量與洗脫體積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)組分的洗脫體積計(jì)算各組分分子質(zhì)量范圍。采用SDS-PAGE測(cè)定PMV及各組分蛋白表觀分子質(zhì)量分布情況。

1.3 血小板聚集率測(cè)定健康大白兔心臟穿刺取血10 mL，枸櫞酸鈉0.109 mol·L-1與血樣以1∶9混合抗凝。抗凝全血130×g離心10 min，取上清得到富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)；剩余部分2600×g離心15 min；取上清得到貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)，用PPP調(diào)節(jié)PRP使血小板為3×1011 L-1。取270 μL PRP與30 μL PMV或G-75分離制備的各蛋白組分37℃預(yù)孵5 min，PMV及各組分終濃度均為0.03 g·L-1，以PBS作為對(duì)照。采用血小板聚集儀測(cè)定5 min最大聚集率。

1.4 酶切發(fā)色底物活性測(cè)定采用單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定和酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法分別測(cè)定PMV及各組分酶切發(fā)色底物S-2251的活性，參照文獻(xiàn)[3]略加改動(dòng)。取50 μL PMV或G-75分離制備的各蛋白組分和50 μL纖溶酶原0.1 U·L-1加入96孔板中，37℃恒溫孵育10 min后加入100 μL S-2251底物0.75 mmol·L-1，然后37℃恒溫避光孵育，單一時(shí)間點(diǎn)法測(cè)定60 min時(shí)A405 nm，酶動(dòng)力學(xué)法每30 min測(cè)定一次A405 nm。PMV及各組分終濃度均為0.05 g·L-1。設(shè)PBS對(duì)照組和不含纖溶酶原對(duì)照組。

1.5 凝血指標(biāo)測(cè)定3只SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，下腔靜脈取血，枸櫞酸鈉0.109 mol·L-1與全血1∶9混合抗凝，960×g離心15 min，取上清得大鼠血漿，將大鼠血漿混合后分裝，-80℃凍存，使用前37℃水浴快速化凍。將大鼠血漿與PMV或G-75分離制備的各蛋白組分在37℃分別孵育5和30 min，按照TT, APTT, PT和FIB試劑盒說明書加入相關(guān)試劑分別進(jìn)行測(cè)定。PMV及各組分在PT和APTT測(cè)定中的終濃度為0.3 g·L-1，在TT和FIB測(cè)定中終濃度為0.2 g·L-1，實(shí)驗(yàn)以PBS作為對(duì)照。

1.6 MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human microvascular endothelial cells，HMEC)由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。HMEC用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，至匯合成單層時(shí)收集待用。取細(xì)胞懸液100 μL(1×108 L-1)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL無血清1640培養(yǎng)基，再加入100 μL不同濃度的PMV或G-75分離制備的各蛋白組分，其終濃度分別為10, 50和250 mg·L-1，對(duì)照組加入等體積PBS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT 5 g·L-1，培養(yǎng)4 h后，每孔加入溶解液50 μL，12 h后用連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定A570 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A570 nm-空白組A570 nm)/(對(duì)照組A570 nm-空白組A570 nm)×100%。

1.7 紅細(xì)胞溶血率測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]方法制備豚鼠紅細(xì)胞懸液。健康豚鼠麻醉后下腔靜脈取血，與等量阿氏液混合，4℃冷藏備用。用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞并配制豚鼠紅細(xì)胞懸液(4×1011 L-1)。取100 μL紅細(xì)胞懸液于試管中，加入待測(cè)樣品，再加入100 μL 0.01%卵磷脂或生理鹽水，各管均用生理鹽水補(bǔ)至1 mL，PMV及經(jīng)G-75分離制備的各組分，終濃度均為0.1 g·L-1。分別孵育0.5, 30, 60和120 min，將試管置于37℃水浴孵育，每隔5 min輕搖試管1次。孵育完畢，以800×g離心10 min后取上清測(cè)定A412 nm，計(jì)算溶血率。實(shí)驗(yàn)同步設(shè)置血球?qū)φ展埽詼p去紅細(xì)胞自發(fā)性溶血所形成的吸收值。溶血率(%)=(樣品管A412 nm-血球管A412 nm)/(全溶管A412 nm-血球管A412 nm)×100%。

2 結(jié)果

2.1 原矛頭蝮蛇毒及蛋白組分分子質(zhì)量PMV經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析分離得到3個(gè)主要的蛋白分離峰，分別合并后命名為FⅠ, FⅡ和FⅢ(圖1)。凝膠過濾測(cè)定各組分的分子質(zhì)量分布范圍分別為FⅠ>71 ku，F(xiàn)Ⅱ 18～37 ku，F(xiàn)Ⅲ<10 ku(圖2)。采用非還原性12%SDS-PAGE測(cè)定PMV及各組分蛋白表觀分子質(zhì)量分布情況(圖 3A)，并用三羥甲基甘氨酸(tricine)-SDS-PAGE進(jìn)一步呈現(xiàn)分子質(zhì)量<10 ku的FⅢ蛋白表觀分子質(zhì)量(圖 3B)。

Fig.1 Gel filtration of Protobothrops mucrosquamatus venom (PMV) on Sephadex G-75 column. Total of 0.5 g of PMV was dissolved in 3 mL of PBS. The solution was centrifuged and the supernatant was applied to the Sephadex G-75 column(2.6 cm×95 cm). The column was eluted at a flow rate of 24 mL·h-1and the elutions were collected 4 mL per tube.

Fig.2 Molecular mass range of fractions by gel filtration on Sephadex G-75 column. The standard curve was generated by callibration markers, and molecular mass range of the fractions was calculated.Mr: relative molecular mass;Ve: elution volume; V0: void volume.

Fig.3 12%SDS-PAGE of PMV and its fractions(F) under non-reducing conditions(A) and tricine-SDS-PAGE of FⅢ under non-reducing conditions(B). A, lane 1：marker; lane 2：PMV; lane 3：FⅢ; lane 4：FⅡ; lane 5：FⅠ; B, lane 1：marker；lane 2：FⅢ.

2.2 原矛頭蝮蛇毒及其組分誘導(dǎo)兔血小板聚集的作用血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，與對(duì)照組相比， PMV和FⅠ 0.03 g·L-1具有明顯的誘導(dǎo)血小板聚集的作用，聚集率分別為(61.0±5.8)%和(56.9±5.9)%(P<0.01)；FⅡ和FⅢ無誘導(dǎo)血小板聚集的活性。

Tab.1 Effect of PMV and its fractions FⅠ, FⅡ and FⅢ on aggregation of rabbit platelet

Drug/g·L-1Aggregation/%Control12．4±4．1PMV 0．0361．0±5．8??FⅠ 0．0356．9±5．9??FⅡ 0．037．4±2．2FⅢ 0．0314．8±4．3

2.3 原矛頭蝮蛇毒及其組分的酶切活性酶切發(fā)色底物S-2251單一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)果(表2)表明，PMV和FⅡ在有纖溶酶原或無纖溶酶原情況下均表現(xiàn)出明顯的酶切活性(P<0.01)。對(duì)具有酶切活性的FⅡ進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在有纖溶酶原和無纖溶酶原條件下，5 h內(nèi)FⅡ酶切底物S-2251酶動(dòng)力曲線基本吻合，且最大反應(yīng)速率分別為6.25±1.97和(6.26±1.93)milli-units·min-1，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

2.4 原矛頭蝮蛇毒及組分對(duì)大鼠凝血功能的影響PMV和FⅠ與血漿孵育過程中即發(fā)生凝固現(xiàn)象，導(dǎo)致無法測(cè)定后續(xù)的凝血功能指標(biāo)。表3結(jié)果顯示，F(xiàn)Ⅱ和FⅢ與血漿孵育5 min即可導(dǎo)致TT, APTT和PT的延長(zhǎng)(P<0.01)，孵育30 min后TT, APTT和PT進(jìn)一步延長(zhǎng)，表現(xiàn)出時(shí)效性；FⅡ和FⅢ與血漿孵育5 min后即導(dǎo)致纖維蛋白原含量低于試劑盒檢測(cè)下限(P<0.01)。

Tab.2 Effect of PMV and its fractions FⅠ, FⅡ and FⅢ on hydrolyzing substrate S-2251

Drug/g·L-1Enzymeactivity(A405nm)WithplasminogenWithoutplasminogenControl0．10±0．040．07±0．02PMV 0．051．82±0．01??1．81±0．05??FⅠ 0．050．13±0．050．09±0．02FⅡ 0．051．88±0．11??1．82±0．03??FⅢ 0．050．13±0．090．08±0．02

2.5 原矛頭蝮蛇毒及組分對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石狀貼壁生長(zhǎng)(圖5A)，PMV, FⅠ和FⅡ可導(dǎo)致HMEC解離懸浮(圖5B,C,D)，F(xiàn)Ⅲ組細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，無細(xì)胞懸浮(圖5E)。MTT檢測(cè)結(jié)果(圖6)表明，PMV、FⅠ和FⅡ能抑制內(nèi)皮細(xì)胞存活，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；FⅡ抑制作用強(qiáng)于FⅠ；FⅢ對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活略有抑制。

Tab.3 Effect of PMV and its fractions FⅠ, FⅡ and FⅢ on thrombin time (TT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT) and fibrinogen (FIB) content of rats

GroupTT/s530(min)PT/s530(min)APTT/s530(min)FIB/g·L-15 30(min)Control29．67±0．5830．33±0．5816．33±0．5816．33±0．5849．67±0．5854．67±1．53##?1．111．16FⅡ41．33±1．53??53．67±1．53??##21．67±0．58??40．67±1．53??##115．67±4．16??127．33±7．77???<0．89??<0．89??FⅢ135．67±4．73??183．67±7．37??##89．67±3．51??105．67±4．93??#117．33±4．04??160．67±3．06??##?<0．89??<0．89??#

Fig.5 Effect of PMV(B) and its fractions FⅠ(C), FⅡ(D) and FⅢ(E) on adhesion of human microvascular endothelial cells (HMECs)(×100). HMECs were exposured to PBS or drug 250 mg·L-1for 24 h. A: normal control.

2.6 原矛頭蝮蛇毒及組分的溶血活性在無卵磷脂條件下，PMV和FⅡ可緩慢地引起紅細(xì)胞輕度溶血(圖7A)。在卵磷脂參與下，PMV和FⅡ可迅速引起豚鼠紅細(xì)胞劇烈溶血，孵育30 s后溶血率即達(dá)到(81.0±4.0 )%和(81.0±1.0)%(P<0.01)；FⅢ的溶血率逐漸上升，孵育60 min后也達(dá)到(89.0±4.0) %(P<0.01)(圖7B)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，PMV在體外具有顯著誘導(dǎo)血小板聚集的活性，而3個(gè)蛋白組分中只有FⅠ表現(xiàn)出誘導(dǎo)血小板聚集活性(聚集率>55%)，提示FⅠ是PMV中引起血小板聚集的主要功能組分。迄今已報(bào)道，PMV中C-型凝集素樣蛋白TMVA[5]和L-氨基酸氧化酶TM-LAO[6]都具有誘導(dǎo)血小板聚集活性，其分子質(zhì)量分別為128.5和110 ku，而FⅠ是分子質(zhì)量>71 ku的蛋白組分。因此，提示上述2類分子參與FⅠ誘導(dǎo)血小板聚集的作用。S-2251是人工合成的用于檢測(cè)纖溶酶及纖溶酶原激活物的小肽發(fā)色底物。本研究發(fā)現(xiàn)，PMV和FⅡ 0.05 g·L-1明顯酶切底物S-2251 0.75 mmol·L-1，提示FⅡ是PMV中酶切發(fā)色底物S-2251的主要組分。為進(jìn)一步了解FⅡ中是否存在纖溶酶原激活物，本研究采用酶動(dòng)力學(xué)方法，觀察FⅡ酶切底物S-2251的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在有或無纖溶酶原條件下，F(xiàn)Ⅱ酶切底物S-2251的酶動(dòng)力曲線基本吻合，且最大反應(yīng)速率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示FⅡ中可能不存在激活纖溶酶原的活性物質(zhì)。迄今已有文獻(xiàn)報(bào)道，PMV中含有纖維蛋白原水解酶[7-8],而本研究結(jié)果提示，PMV中可能不存在纖溶酶原激活物。前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠注射PMV后，TT和APTT明顯延長(zhǎng)[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，出血性蛇毒會(huì)引起消耗性凝血障礙[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅱ和FⅢ明顯使大鼠血漿TT，APTT和PT明顯延長(zhǎng)，推測(cè)TT、APTT和PT的延長(zhǎng)可能是FⅡ和FⅢ中一些蛋白引起凝血因子的消耗所致。目前，在許多蛇毒中發(fā)現(xiàn)了不同的C-型凝集素樣蛋白，它們可直接結(jié)合凝血因子Ⅸ或Ⅹ從而破壞凝血功能[10]，但PMV中是否存在此類蛋白還需要進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著FⅡ和FⅢ與血漿孵育時(shí)間的增加，F(xiàn)Ⅲ延長(zhǎng)血漿TT，APTT和PT更為明顯，F(xiàn)Ⅱ延長(zhǎng)血漿TT和PT更為明顯，推測(cè)FⅡ和FⅢ對(duì)凝血功能的影響可能是其中的酶類所致。纖維蛋白原水平測(cè)定中，F(xiàn)Ⅱ和FⅢ使血漿加入凝血酶后均無法正常凝固，提示FⅡ和FⅢ以不同的方式消耗或降解血漿中纖維蛋白原。因此提示，PMV對(duì)凝血功能的影響是多方面的，不同的蛋白組分對(duì)凝血功能的作用有所不同。前期研究證明，PMV在體內(nèi)可引起大鼠全血和PRP中血小板計(jì)數(shù)下降，TT和APTT延長(zhǎng)，以及小鼠尾部出血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表現(xiàn)出顯著的抗凝作用[2]。本研究表明，PMV和FⅠ可誘導(dǎo)血小板聚集，激活的血小板在機(jī)體內(nèi)被清除后導(dǎo)致體內(nèi)血小板數(shù)量減少，從而影響機(jī)體凝血功能。PMV和FⅠ可引起血漿凝固，提示其中可能含有類凝血酶樣的活性物質(zhì)。類凝血酶在體外使纖維蛋白原變成松散的纖維蛋白，表現(xiàn)為促凝活性。這些松散的纖維蛋白可快速被機(jī)體清除，造成機(jī)體纖維蛋白原水平降低，從而產(chǎn)生抗凝作用[9]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PMV和FⅡ具有酶切發(fā)色底物的活性，提示PMV和FⅡ具有抗凝作用。FⅡ和FⅢ明顯延長(zhǎng)TT，APTT和PT，提示FⅡ和FⅢ從多方面影響凝血因子。因此，PMV中復(fù)雜的蛋白組分在體外對(duì)血小板、纖溶系統(tǒng)和凝血因子表現(xiàn)出不同的活性作用，但它們?cè)隗w內(nèi)綜合作用最終表現(xiàn)為抗凝作用。血管內(nèi)皮是蛇毒進(jìn)入獵物體內(nèi)后攻擊的主要靶標(biāo)，從而引起機(jī)體一系列病理生理反應(yīng)，如水腫、出血和炎癥等。本研究表明，PMV，F(xiàn)Ⅰ和FⅡ引起內(nèi)皮細(xì)胞解離懸浮并抑制內(nèi)皮細(xì)胞存活，提示PMV在體內(nèi)可能會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。PMV，F(xiàn)Ⅰ和FⅡ引起內(nèi)皮細(xì)胞解離的機(jī)制可能是某些酶類水解細(xì)胞外基質(zhì)所致[11]，也可能是非酶蛋白如去整合素樣物質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)整合素位點(diǎn)相互結(jié)合引起細(xì)胞解離懸浮。此外，L-氨基酸氧化酶和磷脂酶A2等一些毒性成分也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死。因此，PMV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的破壞可能是多種蛋白的綜合作用。原矛頭蝮蛇傷的臨床表現(xiàn)中有血尿現(xiàn)象[1]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在注射PMV 15 min后，即出現(xiàn)血尿現(xiàn)象，血中血紅蛋白含量明顯升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有FⅡ 0.1 g·L-1可引起豚鼠紅細(xì)胞溶血，提示FⅡ是PMV中引起溶血的主要組分，其溶血現(xiàn)象在卵磷脂存在的條件下更為明顯。PMV中含有磷脂酶A2[12]，磷脂酶A2可水解紅細(xì)胞膜的卵磷脂釋放出溶血卵磷脂，從而使溶血活性級(jí)聯(lián)放大，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的溶血。因此，提示PMV和FⅡ的溶血活性可能主要是磷脂酶A2所引起的。由于各蛋白組分成分仍然復(fù)雜，因此，在下一步工作中應(yīng)從各組分中進(jìn)一步分離鑒定相關(guān)功能蛋白，并對(duì)單一蛋白成分進(jìn)行研究，以更深入、全面的認(rèn)識(shí)其毒性機(jī)制。

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(本文編輯: 喬 虹)

Effect of Protobothrops mucrosquamatus venom and its fractionson blood coagulation

LI Ya-nan, SUN Qian-yun, LU Qing-yu

(CenterforPharmacologyandDrugScreening,KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts,GuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China)

OBJECTIVE To investigate the effect ofProtobothropsmucrosquamatusvenom (PMV) and its fractions on functions of the circulatory systeminvitroin order to better understand its toxicity mechanism. METHODS PMV was isolated to three fractions FⅠ, FⅡ and FⅢ with a different molecular mass range by Sephadex G-75 gel filtration chromatography. Platelet rich plasma was adjusted to 3×1011L-1by platelet poor plasma. Platelet suspension was incubated with PMV and its fractions 0.03 g·L-1for 5 min, respectively, and platelet aggregation was determined on an LBY-NJ4 aggregometer. PMV and its fractions 0.05 g·L-1were preincubated with plasminogen 0.1 U·L-1for 10 min before chromogenic substrate cleavage activity was measured by endpoint and enzyme kinetics determination. PMV and its fractions 1.0 g·L-1were incubated with rat plasma for 5 or 30 min, and thrombin time (TT), activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT) and fibrinogen (FIB) content were assayed. The microvascular endothelial cells were exposed to PMV and its fractions 10, 50 and 250 mg·L-1, respectively, for 24 h, while the morphological change was observed using an inverted phase contrast microscope, and the cell viability was determined by MTT method. PMV and its fractions were incubated with guinea pig red blood cell suspension in the presence or absence of lecithin for different time, and hemolysis was measured. RESULTS Compared with normal control, platelet aggregation rate was significantly increased by PMV and FⅠ (>71 ku)〔(12.4±4.1)%,(61.0±5.8)% and (56.9±5.9)%〕(P<0.01). PMV and FⅡ (18-37 ku) significantly hydrolyzed chromogenic substrate S-2251(P<0.01). PMV and FⅠ caused plasma coagulation. Compared with normal control, FⅡ and FⅢ (<10 ku) remarkably prolonged TT, APTT and PT(P<0.01). Morphological observation revealed that PMV, FⅠ and FⅡ detached the adherent cells. Compared with normal control group, PMV, FⅠ and FⅡ inhibited cell viability, and the survival rate of the cells decreased to (56.8±3.6)%,(71.6±3.8)% and(58.2±5.5)%, respectively. PMV and FⅡ slowly caused slight hemolysis in absence of lecithin. PMV and FⅡ caused significant hemolysis in the presence of lecithin, and the hemolytic rate increased to (81.0±4.0)% and (81.0±1.0)%(P<0.01)in 0.5 min, respectively, compared with (17.7±1.0)% of the control group. CONCLUSION PMV possesses different activities that affect the functions of the circulatory systeminvitro, and the fractions play different roles in toxicity mechanisms.Key words:Protobothropsmucrosquamatusvenom; hemolysis; anticoagulation; platelet aggregation

SUN Qian-yun, Tel: (0851)83805095, E-mail: sunqy@hotmail.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260494)

李亞男(1985- )，女，碩士研究生，主要從事天然藥物成分及生理活性研究；孫黔云(1968- )，男，博士，研究員，主要從事心血管藥理與新藥發(fā)現(xiàn)研究。

孫黔云，Tel: (0851)83805095, E-mail: sunqy@hotmail.com

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China(81260494)

2014-08-15 接受日期: 2015-02-10)

R996.3

A

1000-3002(2015)02-0284-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.016

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