梁月琴，王崇靜，王 珩，李仲昆

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南 昆明 650051）

云南雀嘴茶對(duì)免疫功能低下小鼠的保護(hù)作用

梁月琴，王崇靜，王 珩，李仲昆

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南 昆明 650051）

目的研究雀嘴茶的免疫調(diào)節(jié)作用。方法取雄性ICR小鼠，制作環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠模型，分別給予雀嘴茶及蒸餾水灌服，取血清。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定小鼠血清的白細(xì)胞介素-2（IL-2）、 -干擾素（IFN- ）的含量，用流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠血清 CD4，CD8，CD3的水平。用紫外法測(cè)定血清溶血素的含量。結(jié)果雀嘴茶能夠提高小鼠血清中 CD4，CD8，CD3的百分比分別至（31．56±6．51）%，（11．47±3．63）%，（2．91±0．82）%，提高 IL-2及 IFN- 的含量分別至（562．74±43．82）pg／L和（1 035．40± 44．84）pg／L，提高溶血素的吸光度（OD）值至（1．380±0．159），與模型組相比，均有顯著性差異(P＜0．05或0．01)。結(jié)論雀嘴茶具有提高小鼠免疫功能的作用。

雀嘴茶；小鼠；免疫功能

雀嘴茶 Vaccinium dunalianum W．是云南特有的茶葉品種，《中藥大辭典》等典籍稱其能活絡(luò)散瘀、祛風(fēng)除濕炎。近年來(lái)，有很多學(xué)者開(kāi)始研究中藥及其復(fù)方制劑在免疫調(diào)節(jié)中的作用[1]，并取得了令人矚目的成就。但關(guān)于雀嘴茶的研究較少[2-3]，其對(duì)免疫功能影響的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中通過(guò)流式法測(cè)定小鼠血清 T淋巴亞群 CD4，CD8，CD3的水平，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定小鼠血清白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）的含量，紫外分光光度法測(cè)定小鼠血清溶血素，觀察雀嘴茶對(duì)免疫抑制小鼠的調(diào)節(jié)作用，旨在探討雀嘴茶對(duì)小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

試藥：雀嘴茶由云南天秀植物科技有限公司在云南省楚雄州采集后，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李錫文教授鑒定為正品，磨細(xì)制備成粉。注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為09080521）；ELISA試劑盒（IFN-γ，IL-2）購(gòu)于晶美公司；流式試劑mouse CD4FITC，mouse CD8-PE，mouse CD3E PE-CY5，購(gòu)于BD公司。5%雞紅細(xì)胞（CRBC）的制備，取新鮮雞血，不斷攪拌除掉纖維蛋白，用0．9%氯化鈉注射液配制成5%CRBC混懸液備用。補(bǔ)體的制備，豚鼠4只，雌雄各半，氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉后，抽取心臟血，分離每只豚鼠的新鮮血清，混合后備用，臨用時(shí)用0．9%氯化鈉注射液稀釋至1∶10。

動(dòng)物：ICR雄性小鼠72只，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科，體重（20±2）g，動(dòng)物試驗(yàn)許可證號(hào)為SCXK（滇）2005-0008。

儀器：Bio-RAD680型酶標(biāo)儀；全自動(dòng)流式儀（美國(guó) BD公司）；UV-2401-PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1．2 方法

小鼠血清 CD4，CD8，CD3，IFN-γ，IL-2影響試驗(yàn)[4]：取雄性ICR小鼠36只，隨機(jī)均分為3組，A組為空白對(duì)照組，B組為環(huán)磷酰胺模型組，C組為雀嘴茶組。C組灌服雀嘴茶，共給藥7 d，給藥劑量為0．5 g／kg；B組、C組每天灌服蒸餾水0．3 mL；C組、B組于第 2天進(jìn)行環(huán)磷酰胺腹腔注射，100 mg／kg。各組于第8天取血。取各組血清，按照IFN-γ及IL-2試劑盒說(shuō)明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定小鼠血清中IFN-γ及 IL-2的含量；用流式儀測(cè)定肝素抗凝血的T細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)。

小鼠血清溶血素影響試驗(yàn)[5]：取雄性ICR小鼠36只，隨機(jī)均分為3組，A組為雞紅細(xì)胞模型組，B組為環(huán)磷酰胺組，C組為雀嘴茶組。試驗(yàn)開(kāi)始后，A組、B組每天灌服蒸餾水0．3 mL；C組灌服藥物，共給藥7 d，劑量為0．5 g／kg。3組均于第1天腹腔注射5%雞紅細(xì)胞混懸液0．4 mL，B組和C組于第2天腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg／kg。于給藥后第8天，取小鼠血，加入1．5 mL離心管中，放置1 h，離心后取血清，用0．9%氯化鈉注射液稀釋200倍，取稀釋血清2．0 mL，與10%補(bǔ)體血清1．0 mL及5%雞紅細(xì)胞混懸液1．0 mL混合，置37℃恒溫箱中孵育30 min，然后在0℃冰箱中放置30 min終止反應(yīng)，以3 000 r／min轉(zhuǎn)速離心，取上清液，參照文獻(xiàn)[6]，用紫外分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（OD）值。以不加血清的空白對(duì)照管上清液作對(duì)照比色。

2 結(jié)果

2．1 雀嘴茶對(duì)小鼠血清IFN- 及IL-2水平的影響

結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，雀嘴茶可升高環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的血清IFN-γ及IL-2的水平。

表1 雀嘴茶對(duì)小鼠血清IL-2及IFN- 水平的影響（，pg／L，n=12）

表1 雀嘴茶對(duì)小鼠血清IL-2及IFN- 水平的影響（，pg／L，n=12）

注：與B組比較， P＜0．05， P＜0．01。下表同。

組別A組B組C組IFN-1 033．50±36．20 939．04±91．74 1 035．40±44．84 IL-2 546．22±37．31 410．91±85．41 562．74±43．82

2．2 雀嘴茶對(duì)小鼠血清T細(xì)胞亞群水平的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果顯示，B組和 C組的總 T淋巴細(xì)胞（CD3）百分比低于A組，說(shuō)明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能有損傷，B組的 T輔助細(xì)胞（CD4）百分比降低較明顯；從 CD4／CD8分析，C組較 B組明顯升高（P＜0．01），提示雀嘴茶可能通過(guò)提高CD4／CD8來(lái)改善小鼠細(xì)胞免疫功能。

表2 雀嘴茶對(duì)小鼠血清細(xì)胞亞群水平的影響（，n=12）

表2 雀嘴茶對(duì)小鼠血清細(xì)胞亞群水平的影響（，n=12）

組別A組B組C組CD4（%）29．30±6．14 22．85±6．72 31．56±6．51 CD8（%）14．60±3．68 17．63±5．96 11．47±3．63 CD4／CD82．06±0．46 1．51±0．55 2．91±0．82 CD3（%）63．91±14．84 37．40±9．77 50．98±10．57

2．3 雀嘴茶對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，A組和B組相比有顯著性差異(P＜0．01)，說(shuō)明造模成功，小鼠腹腔注射雞紅細(xì)胞后，會(huì)引起溶血素含量升高；小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，會(huì)引起血清溶血素下降。給小鼠灌服雀嘴茶可升高小鼠血清溶血素含量，C組與B組相比有顯著差異(P＜0．01)，提示雀嘴茶能增強(qiáng)小鼠的血清溶血素含量，提高小鼠機(jī)體特異性體液免疫功能。

表3 雀嘴茶對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響（）

表3 雀嘴茶對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響（）

組別A組B組C組動(dòng)物只數(shù)12 12 12 OD值1．922±0．353 0．993±0．126 1．380±0．159

3 討論

疾病的發(fā)生與免疫功能密切相關(guān)。在正常情況下，各種免疫細(xì)胞的相互調(diào)控處于平衡狀態(tài)，如果這些平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能發(fā)生紊亂，使機(jī)體容易受到外界致病菌的入侵而發(fā)病[7]。因此，免疫功能的保護(hù)對(duì)預(yù)防和治療疾病具有重要意義。

試驗(yàn)周期可為14 d，也可為7 d。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，兩種方法均能成功造模，且灌服藥物后能體現(xiàn)差異，因此均采用7 d的試驗(yàn)周期。

血清中溶血素的水平被認(rèn)為是反映體液免疫功能的重要指標(biāo)[8]。本試驗(yàn)中用新鮮的雞紅細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，從而使小鼠體內(nèi)溶血素水平有所提高。取小鼠新鮮血清與新鮮雞紅細(xì)胞按一定比例混合，在補(bǔ)體（豚鼠血清）參與下發(fā)生溶血、釋放血紅蛋白，通過(guò)紫外法測(cè)定吸光度值，可反映出小鼠體內(nèi)血紅蛋白的變化，從而確定溶血素的含量變化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠灌服雀嘴茶后，血清中溶血素吸光度值與環(huán)磷酰胺組相比有顯著提高，表明雀嘴茶能促進(jìn)小鼠的體液免疫功能。

體液免疫效應(yīng)是由B細(xì)胞通過(guò)對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別、活化、增殖，然后分化成漿細(xì)胞并分泌抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)中，雀嘴茶組小鼠的IL-2和IFN-γ水平顯著高于模型組，說(shuō)明雀嘴茶能提高小鼠的免疫功能[9]。

T細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答具有重要調(diào)節(jié)的功能，CD4+T細(xì)胞對(duì)病原體沒(méi)有直接損傷作用，主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子起作用[10-11]，如經(jīng)抗原識(shí)別、活化、增殖合成和分泌大量的各種免疫細(xì)胞因子發(fā)揮作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雀嘴茶組的總T淋巴細(xì)胞CD4、CD3百分比明顯高于環(huán)磷酰胺組，表明雀嘴茶對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能具有恢復(fù)作用。

[1]張愛(ài)萍，徐今寧．中藥免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)藥業(yè)，2011，20（3）：75-77．

[2]李 菊．雀嘴茶藥學(xué)基礎(chǔ)研究[D]．昆明：昆明醫(yī)學(xué)院，2007．

[3]李 菊，胡煒彥，張榮平，等．雀嘴茶急性毒性、病理學(xué)及其化學(xué)成分的初步研究（摘要）[J]．昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（4）：129．

[4]楊 錯(cuò)，邢立國(guó)，劉玉蘭．柴胡乳劑對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（3）：169-171．

[5]劉榮珍，李風(fēng)文，李裕生，等．綿羊紅細(xì)胞與雞紅細(xì)胞對(duì)小白鼠溶血素的影響的探討[J]．廣西醫(yī)學(xué)，2003，25（9）：1 739．

[6]華 偉，李 凡，米新陵，等．刺山柑軟膏對(duì)小鼠血清溶血素的影響[J]．中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2011，27（1）：26-27．

[7]郝燕生，楊玉明．復(fù)方參芪維E膠囊聯(lián)合泛昔洛韋對(duì)帶狀皰疹患者免疫功能的影響[J]．中國(guó)藥業(yè)，2014，16（23）：32-33．

[8]楊鐵虹，盧保華，賈 敏，等．當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（4）：448-451．

[9]羅曉麗，楊 侃，孫 明．黃芪扶正湯對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能[J]．中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（6）：555-558．

[10]Rose CM，Kimzey SL，Green JM．The host response of CD28-deficient mice to Pneumocystisinfection[J]．Microb Pathog，2006，40（1）：23-28．

[11]何茂銳，萬(wàn)榮珍，謝雪梅，等．匹多莫德對(duì)艾滋病并肺孢子蟲肺炎的臨床療效及細(xì)胞免疫功能的影響[J]．中國(guó)藥業(yè)，2014，11（23）：20-21．

Protecting Effect of Lyonia Ovalifolia（W．）Produced in Yunnan on Mice with Lowered Immune Function

Liang Yueqin，Wang Chongjing，Wang Heng，Li Zhongkun
（Yunnan Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yunnan，China 650051）

Objective To investigate the immunomodulatory effect of Lyonia ovalifolia（W．）．Methods The cyclophosphamid induced immunosupression mice model was prepared in the male ICR mice and gavaged by Lyonia ovalifolia（W．）and the distilled water for taking serum．The ELISA was used to detect the concentrations of serum interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）．The flow cytometry was adopted to detect the percentages of serum CD4，CD8and CD3．The UV was adopted to detect the concentration of serum hemolysin．Results Lyonia ovalifolia（W．）could enhance the percentages of serum CD4，CD8and CD3to（31．56±6．51）%，（11．47± 3．63）% and（2．91±0．82）% respectively，the contents of IL-2 and IFN-γ to（562．74±43．82）pg／L and（1035．40±44．84）pg／L respectively，and the absorbance degree（OD）of hemolysin to(1．380±0．159)，which had statistical differences compared with the model group．Conclusion Lyonia ovalifolia（W．）has the effect for increasing the immunologic function in mice．

Lyonia ovalifolia（W．）；mice；immune function

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2015)04－0025－02

梁月琴（1963-），女，大學(xué)本科，主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作，（電話）0871-63211161（電子信箱）1598203375＠qq．com；李仲昆，主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)和中藥研發(fā)工作，本文通訊作者，（電話）0871-63211154。

2014－10－27；

2014－12－22)