唐 茜，孫魯寧，沈 燕，張宏文，陸 超，龔曉健，王永慶**

1中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，南京 210009；南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2臨床藥理研究室，3兒科，南京210029

HPLC法與EMIT法測(cè)定人血中甲氨蝶呤血藥濃度差異分析*

唐 茜1，2，孫魯寧2，沈 燕3，張宏文2，陸 超3，龔曉健1**，王永慶2**

1中國(guó)藥科大學(xué)藥理教研室，南京 210009；南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2臨床藥理研究室，3兒科，南京210029

目的：比較酶增強(qiáng)免疫分析法（EMIT）和高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定甲氨蝶呤（MTX）血藥濃度結(jié)果，并分析兩種測(cè)定方法所得結(jié)果存在偏差的原因。方法：7例骨肉瘤患者，采用大劑量（10 g·m-2）甲氨蝶呤靜脈滴注后，同時(shí)采用EMIT法和HPLC法測(cè)定血漿中MTX藥物濃度，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：骨肉瘤患者給藥后48、60、96 h的血藥濃度，采用EMIT法測(cè)得的值約是HPLC法測(cè)得值的1.72倍；采用EMIT法測(cè)得的血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HPLC法測(cè)得的MTX及其代謝物7-羥基甲氨喋呤 （7-OHMTX）的濃度之和。結(jié)論：MTX的主要代謝物7-OHMTX與EMIT法檢測(cè)MTX存在顯著的交叉反應(yīng)，這可能造成EMIT法測(cè)定結(jié)果高于HPLC法。

酶增強(qiáng)免疫法；高效液相色譜法；甲氨蝶呤；7-羥基甲氨喋呤血藥濃度

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）為葉酸類抗腫瘤藥，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，推遲和阻礙DNA和RNA的合成而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。MTX在體內(nèi)代謝的個(gè)體差異較大，其療效、毒性均與使用劑量相關(guān)，因此HDMTX-CF化療風(fēng)險(xiǎn)很大，必須通過(guò)監(jiān)測(cè)MTX血藥濃度，及時(shí)調(diào)整MTX使用劑量和亞葉酸鈣的解救劑量，在確保療效的同時(shí)防止嚴(yán)重毒副反應(yīng)的發(fā)生[2]。

目前測(cè)定甲氨蝶呤血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和酶增強(qiáng)免疫法（EMIT）、液質(zhì)聯(lián)用法等[3-4]。HPLC法專一性強(qiáng)，可將藥物與代謝產(chǎn)物分離，是檢測(cè)MTX血藥濃度常用方法[4-5]。酶免疫增強(qiáng)法（EMIT）是一種均相酶免疫分析技術(shù)，檢測(cè)是基于樣本中的藥物與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 （G-6-PDH）標(biāo)記的半抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，與抗體結(jié)合后，酶的活性降低，可以根據(jù)酶的活性來(lái)確定樣本中待測(cè)物的濃度[6]；該法專屬性不強(qiáng)，不能區(qū)分MTX及其活性代謝物的各自濃度，而且需要使用儀器配套試劑盒，價(jià)格較昂貴，且線性范圍較窄，如遇到高濃度樣本時(shí)需要稀釋重新檢測(cè)，從而增加檢測(cè)成本及實(shí)驗(yàn)時(shí)間[7]。本文通過(guò)2種方法測(cè)定同一份樣本，比較各自的濃度差異，從而為臨床合理用藥提供參考。

1 材 料

1.1 儀器和試劑

Agilent Technologies 1290 Infinity高效液相色譜儀；VIVA全自動(dòng)免疫分析儀（美國(guó)德靈公司）。

甲氨蝶呤（純度：99.4%，批號(hào)：100138-201104，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；7-羥基甲氨蝶呤 （純度：98%，批號(hào)：11-THT-2-1，Toronto Research Chemicals Inc.）；替硝唑 （純度：99.9%，批號(hào)：100336-200703，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號(hào)：707172，Merck公司）、乙腈 （批號(hào)：711922，Merck公司）、甲酸（批號(hào)：E1404004，Aladdin indus-trial corporation）均為色譜純。

1.2 樣本的收集

收集2013年9月至2014年9月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科使用大劑量（10 g·m-2）甲氨蝶呤的7例骨肉瘤患者的血樣，時(shí)間點(diǎn)為給藥后48、60、96 h。

2 方 法

2.1 HPLC法

2.1.1 色譜條件 ZORABX Eclipse Plus C18分析柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.25%甲酸-乙腈（95∶5，v/v）；柱溫：35℃；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：305 nm。

2.1.2 樣本處理步驟 （1）將肝素抗凝的全血樣本于8000 r·min-1離心8 min，取上清液300 μL。（2）加入內(nèi)標(biāo)液替硝唑30 μL（50 ng·mL-1），渦旋混勻。（3）加入甲醇150 μL，乙腈1 mL，于2000 r·min-1渦旋10 min，16000 r·min-1離心15 min。（4）取上清液，置于離心濃縮儀，45℃，3.5 h，吹干。（5）在吹干后的各試管中加入 0.1%甲酸溶液200 μL，渦旋5 min，16000r·min-1離心15min。（6）取上清液，進(jìn)樣20μL。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取MTX及7-OHMTX混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg·mL-1）適量，分別加入空白血漿，使甲氨蝶呤及7-OHMTX濃度為0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL-1的模擬血漿樣品，按“2.1.2樣本處理步驟”操作，以MTX或7-OHMTX的血藥濃度為C，MTX或7-OHMTX與內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積比值為f作回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。MTX的線性方程為：f1=0.006+0.304C（r= 0.9940）；7-OHMTX的線性方程為：f2=0.000+0.256C（r=0.9930）。本法兩者的最低檢測(cè)限均為0.03 μg· mL-1。

2.1.4 精密度及準(zhǔn)確度測(cè)定 分別取高、中、低3種濃度的MTX及7-OHMTX的質(zhì)控品，分別于同日和不同日測(cè)定日內(nèi)、日間RSD并考察其準(zhǔn)確度（見(jiàn)表1）。

表1 HPLC法測(cè)定MTX和7-OHMTX的準(zhǔn)確度和精密度

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取高、中、低3種濃度的質(zhì)控樣本，分別考察其室溫、放置24 h的穩(wěn)定性，-80℃冷凍保存7天的穩(wěn)定性，反復(fù)凍融2次的穩(wěn)定性，結(jié)果無(wú)明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）＜15%。

2.2 EMIT法

使用德靈公司的VIVA全自動(dòng)免疫分析儀，按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，每批次樣本測(cè)定時(shí)隨行質(zhì)控品平行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

研究結(jié)果表明，骨肉瘤患者開(kāi)始給藥后48、60、96 h使用EMIT法測(cè)得的血藥濃度約是HPLC法測(cè)得MTX值的1.72倍；EMIT法測(cè)得的血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HPLC法測(cè)得的MTX及其代謝物7-OHMTX濃度之和。HPLC法測(cè)得的7-OHMTX血藥濃度通常是MTX濃度的十幾倍甚至更高。見(jiàn)表3。

表2 EMIT法測(cè)定MTX的準(zhǔn)確度和精密度

表3 骨肉瘤患者給予MTX 48、60、96 h后血藥濃度兩種方法測(cè)定結(jié)果比較（n=5）

3 討 論

VIVA全自動(dòng)免疫分析儀帶有自動(dòng)取樣系統(tǒng)和良好控溫系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理與貯存器，具有自動(dòng)化程度高、樣本用量少、樣本不需要預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)，適用于急診和大樣本的分析測(cè)定。HPLC法可將藥物和體內(nèi)代謝物良好分離，儀器精密度好，但操作時(shí)程長(zhǎng)，特別是血漿樣品前處理較繁瑣。但由于EMIT法是利用抗原、抗體相互識(shí)別并結(jié)合來(lái)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，當(dāng)某些抗原具有與待測(cè)藥物相同的抗原表面標(biāo)志或者抗體有著多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，可導(dǎo)致抗體與那些化學(xué)結(jié)構(gòu)相近于母體的代謝產(chǎn)物及樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，其結(jié)果會(huì)出現(xiàn)偏差。從測(cè)定的結(jié)果分析，采用EMIT法測(cè)定的MTX血藥濃度明顯高于采用HPLC-UV法。MTX在細(xì)胞外主要代謝成7-OHMTX和一些4-氨基-4-脫氧-N10-甲基喋酸（DAMPA），盡管這些代謝物與二氫葉酸還原酶的親和力更低，但因?yàn)樗鼈兣cMTX的相似結(jié)構(gòu)，在EMIT法測(cè)定時(shí)會(huì)干擾MTX的濃度測(cè)定[8-9]。在肝臟中大量的MTX被乙醛氧化酶氧化，產(chǎn)生7-OHMTX。7-OHMTX的血藥濃度可能會(huì)超過(guò)MTX，尤其在使用大劑量MTX的患者體內(nèi)，在給藥后10～12 h 7-OHMTX成為最主要的代謝物。該代謝物與MTX相比對(duì)二氫葉酸還原酶的親和力更低，但它的多聚谷氨酸鹽衍生物抑制胸苷酸合酶和二氫葉酸還原酶的效能，卻與MTX多聚谷氨酸不相上下。7-OHMTX因其緩慢的消除率能夠減弱MTX的療效，同時(shí)在細(xì)胞水平，通過(guò)與MTX競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)的多聚谷氨酸化，甚至可引起對(duì)MTX的抵抗[10-11]。而且 EMIT測(cè)出的濃度主要也是 MTX和 7-OHMTX的濃度之和，這很可能就是EMIT法測(cè)得的MTX血藥濃度高于HPLC法測(cè)得值的原因。

[1] 任秀華，杜 光，劉 東.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中甲氨蝶呤的血藥濃度及其臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（10）：801-4.

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Comparison of EMIT and HPLC Method in Monitoring Methotrexate in Osteosarcoma Patients Blood*

TANG Qian1,2,SUN Lu-ning2,SHEN Yan3,ZHANG Hong-wen2,LU Chao3, GONG Xiao-jian1**,WANG Yong-qing2**
1China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Research Division of Clinical Pharmacology,3Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029

Objective:To compare the results of plasma methotrexate (MTX)concentrations determined by enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT)and high performance liquid chromatography(HPLC) method in osteosarcoma patients.Methods:Seven patients received large-dose(10 g·m-2)MTX through in-travenous infusion.Plasma MTX levels were evaluated by EMIT and HPLC for comparison.Results:Plas-ma MTX concentrations determined by EMIT after the administration for 48,60 and 96 h were about 1.72 times of those by HPLC method.MTX levels determined by EMIT were lower than the total concentrations of MTX and 7-Hydroxymethotrexate (7-OHMTX)determined by HPLC.Conclusion:7-OHMTX,which is the major plasma metabolite of MTX,has cross-reactivity with MTX when determined by EMIT,and may influence the concentration results of MTX measured by EMIT.

Enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT);High performance liquid chromatogra-phy(HPLC);7-Hydroxymethotrexate methotrexate;Plasma concentration

R969.1

A

1673-7806（2015）02-141-03

江蘇省醫(yī)療器械重點(diǎn)項(xiàng)目（BM2011017）；江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才項(xiàng)目（RC201170，H201108）

唐茜，女，碩士 E-mail:452022435@qq.com

* *通訊作者龔曉健，男，副教授 E-mail:gongxj99@163.com王永慶，男，主任藥師 E-mail:wyqjsph@163.com

2014-10-24

2014-12-11