陳 翔 吳曙輝 陸寶華 袁 杰 耿春華 曾小兵

結直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，近幾年來，發(fā)病率明顯上升，臨床上判斷預后多通過分析腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移情況、分期、組織分級等。基質(zhì)金屬蛋白酶中的基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)主要降解VI型膠原，參與腫瘤血管形成、腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。本文通過免疫組織化學法檢測老年結直腸癌患者中MMP-2、MMP-9的表達，探討兩者與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取于2012年3月至2014年9月在我院普外科住院行結直腸癌根治術患者86例作為實驗組，均經(jīng)過病理組織學切片檢查明確診斷，其中男性49例，女性37例，年齡63～84歲，平均年齡(65.2±5.3)歲。組織學類型:腺癌63例，其他類型23例。病理學分級:高分化32例，中分化33例，低分化21例。腫瘤直徑＜5 cm者37例，5～10 cm者34例，＞10 cm者15例;局部有淋巴結轉(zhuǎn)移者49例，無轉(zhuǎn)移者37例;TNM分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。取該組病例距腫瘤邊緣5 cm以上相應癌旁正常組織作為對照組。所有患者術前均未接受放療、化療或生物治療。

1.2 試劑及儀器

兔抗人MMP2、MMP-9多克隆抗體、SP通用型試劑盒、DAB試劑盒、多聚賴氨酸、檸檬酸抗原修復液、PBS、過氧化氫、二甲苯，無水乙醇，石蠟，蘇木精，中性樹膠(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

超凈工作臺(Formal205型，美國);倒置顯微鏡(Olympus，日本);水浴箱(江蘇金坑市醫(yī)療儀器廠);組織包埋機(SAKURA，日本);脫水機(TIYODA，日本);超薄切片機(Leica，德國);臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設備有限公司);高壓鍋(美的，中國);電熱風干燥箱(中國上海圣欣科學儀器有限公司);耐高溫塑料染色架(中國福州邁新生物科技有限公司);計算機圖像分析系統(tǒng)(惠普，美國)。

1.3 實驗方法

福爾馬林液固定;脫水、透明;浸蠟、包埋;切片、貼片、烤片;脫蠟、脫水;高壓熱修復;阻斷:3%過氧化氫孵育10 min;封閉:山羊血清封閉液室溫孵育10 min;加一抗50 μl室溫靜置1 h;加辣根過氧化物酶標記的二抗50 μl靜置10 min;加鏈霉親和素-過氧化物酶50 μl靜置10 min;顯色;終止;蘇木精復染，鹽酸酒精分化;常規(guī)脫水、透明;封片;顯微鏡下觀察。

1.4 判斷標準

以已知的該指標的免疫組化染色陽性片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，HE切片作為對照觀察。

MMP-2、MMP-9陽性結果判定以細胞核不染色，細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，陰性(-):染色細胞數(shù)≤10%;弱陽性(+):染色細胞數(shù)11% ～25%;陽性(++):染色細胞數(shù)26% ～50%;強陽性(+++):染色細胞數(shù)＞50%。以上均以(-)為陰性;(+)～(+++)為陽性。圖像分析:計算機圖像系統(tǒng)拍照，每張切片隨機選取5個視野，并記錄。

2 結果

2.1 MMP-2、MMP-9在兩組中的表達情況

對兩組組織進行免疫組化SP法檢測，結果發(fā)現(xiàn)，實驗組 MMP-2強陽性(+++)28例，陽性率73.26%，MMP-9強陽性(+++)表達32例，陽性率69.77%;對照組 MMP-2、MMP-9 均無強陽性表達，陽性率分別為11.63%、9.30%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(MMP-2 χ2=66.853，MMP-9 χ2=65.765，P 均＜0.01)，見表1。

表1 MMP-2、MMP-9在兩組中的表達情況

2.2 MMP-2、MMP-9表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

MMP-2和MMP-9的表達水平均與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小和病理學類型、組織學類型無關，而與腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(P ＜0.05)，見表 2。

3 討論

結直腸癌作為常見的惡性腫瘤，老年人的發(fā)病率逐年升高，是由多因素、多基因、多階段參與的，其惡性程度主要由浸潤和轉(zhuǎn)移特性決定，而這種特性又是由惡性腫瘤細胞的增殖、細胞外基質(zhì)的降解及大量血管生成決定的［2］。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是蛋白水解酶家族，主要依賴鋅離子，能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移［3］。MMP-2是非糖化明膠酶，研究表明MMP-2能夠?qū)е履[瘤細胞介導的細胞外基質(zhì)降解，參與腫瘤新生血管形成、腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。除此之外，MMP-2還能調(diào)節(jié)細胞粘附，降低細胞間粘附力，腫瘤細胞易于脫落形成遠處轉(zhuǎn)移［5］。

MMP-9是明膠酶B，能夠降解明膠、彈性纖維、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和X型膠原，在多種惡性腫瘤中高表達，研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌基底膜Ⅳ型膠原蛋白的缺失與組織MMP-9表達增強有關［6］。有報道稱MMP-9拮抗劑抑制結直腸癌細胞黏附，表明MMP-9促進結直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。

表2 MMP-2、MMP-9表達與結直腸癌臨床病理特征的關系(例，%)

在本實驗中，選取經(jīng)病理證實為結直腸癌的組織作為實驗組，癌旁正常組織作為對照組，采用免疫組織化學法檢測兩組組織內(nèi)MMP-2、MMP-9的表達，結果發(fā)現(xiàn)實驗組 MMP-2強陽性28例，陽性率73.26%，MMP-9強陽性表達32例，陽性率69.77%;對照組MMP-2、MMP-9均無強陽性表達，陽性率分別為11.63%、9.30%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。對兩組組織中MMP-2、MMP-9的表達與性別、腫瘤部位、病灶大小、TNM分期、組織學類型、病理學類型、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移等方面的關系進行分析，結果發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP-9的表達水平均與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小和病理學分型、組織學類型無關，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關，統(tǒng)計學顯示有差異。這提示，MMP-2、MMP-9在結直腸癌組織中表達升高，并且隨著腫瘤浸潤深度深、有淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，結直腸癌組織中MMP2和MMP-9表達越高。既往研究表明，在人體多種惡性腫瘤中，MMP-2高表達導致細胞外基質(zhì)降解，腫瘤新生血管生成，腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移［8］。MMP-9在結直腸癌組織中高表達，在非癌組織中也有少量的表達，能夠起到腫瘤抑制因子的作用［9］。截止目前，絕大部分研究均發(fā)現(xiàn)MMP-9能夠加速腫瘤細胞增殖，促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［10］。這均與本實驗結果相一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9在結直腸癌組織中高表達，兩者的表達與結直腸癌浸潤深度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。MMP-2和MMP-9與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機制仍需進一步實驗研究，為臨床上尋找結直腸癌新的治療方式提供理論依據(jù)。

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