魯玉榮，袁莉剛，王勛，張輝，甘利鵬，黃寧，閆振龍，陳國娟，張吉文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞增齡性變化特征

魯玉榮，袁莉剛，王勛，張輝，甘利鵬，黃寧，閆振龍，陳國娟，張吉文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：為了比較分析不同月齡藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞發(fā)育特征，探索其發(fā)育特征與生精功能的關(guān)系.應(yīng)用組織化學(xué)方法及電子顯微鏡技術(shù)，研究了1～6月齡羔羊睪丸leydig細胞增齡性變化特征.光鏡觀察結(jié)果表明： leydig細胞及其周圍間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)隨月齡增齡性變化明顯.1，2月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)毛細血管分布較少，管壁內(nèi)皮細胞較圓，發(fā)育不完善，周圍有散在的紡錘形或星形的幼稚成纖維細胞，結(jié)締組織分布較少；3，4月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)血管內(nèi)皮細胞發(fā)育完善,巨噬細胞位于間質(zhì)血管周圍,細胞較大,形態(tài)不規(guī)則,結(jié)締組織有所增加；5，6月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)毛細血管數(shù)量增多，管壁內(nèi)皮細胞包圍成形，成纖維細胞呈長索狀，輪廓清楚，核仁大而明顯，結(jié)締組織明顯增加.電鏡下觀察結(jié)果表明，3月齡之前睪丸leydig細胞以幼稚型為主，核較圓，異染色質(zhì)較多，胞體近卵圓形；3月齡的羔羊睪丸leydig細胞體積明顯增大，可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿內(nèi)有少量分泌性顆粒出現(xiàn).4月齡及以后的羔羊leydig細胞體積大，胞核多不規(guī)則，核仁明顯，胞漿內(nèi)空泡及分泌性顆粒明顯增多；間質(zhì)成纖維細胞呈長索狀，血管壁內(nèi)皮細胞包圍成形.因此，3月齡之前，藏綿羊羔羊leydig細胞處于胚胎型向成熟型過渡時期；4月齡以后逐漸發(fā)育成熟，為leydig細胞的局部分泌調(diào)節(jié)提供結(jié)構(gòu)支持，對生精小管的進一步發(fā)育以及后期精子發(fā)生具有重要意義.

關(guān)鍵詞：藏綿羊羔羊；睪丸；leydig細胞；睪丸間質(zhì)

第一作者：魯玉榮(1990-)，女，研究方向為動物發(fā)育生物學(xué).E-mail:1308065453@qq.com

1850年，Leydig首次描述了光鏡下睪丸leydig細胞的形態(tài)，此后許多學(xué)者從功能、發(fā)育、分化等不同方面，對leydig細胞做了大量研究[1].睪丸leydig細胞不同于生殖細胞和sertoli細胞，其數(shù)量增加不是靠自身的有絲分裂，而是由間充質(zhì)細胞分化而成，這種分化能力從胚胎時即存在，參與leydig細胞的更新[2].Manicin等[1]研究表明，人類leydig細胞的發(fā)育可以分為胚胎期、哺乳期、少年期、青春期及成年期,指出在胚胎期間充質(zhì)細胞分化為幼稚型leydig細胞,然后再分化為成熟型,但是大部分呈退化型.據(jù)Mori報道[3]，睪丸leydig細胞占睪丸體積的2.7%，睪酮的產(chǎn)生主要是來自leydig細胞，其可促進精子發(fā)生和雄性生殖器官發(fā)育，維持第二性征和性功能.迄今為止，關(guān)于人及實驗動物大鼠、小鼠等leydig細胞形態(tài)及生物學(xué)功能的研究較多，但是對長期生活在高海拔地區(qū)土著動物leydig細胞的研究較少.朱峻峰等[4]研究了不同發(fā)育階段牦牛睪丸leydig細胞的發(fā)育特點，認為在1歲時牦牛leydig細胞數(shù)量增加明顯，但是對藏綿羊睪丸leydig細胞結(jié)構(gòu)特征尚未見報道.本研究擬通過組織化學(xué)觀察結(jié)合透射電鏡技術(shù)，認識藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞發(fā)育特點，比較性成熟前不同月齡藏綿羊睪丸leydig細胞發(fā)育特征，分析其組織形態(tài)變化規(guī)律,為高原哺乳動物生殖生理研究提供參考.

1材料與方法

1.1試驗材料

在青海省西寧市大通縣牧區(qū),收集采取1～6月齡藏綿羊睪丸各8～10對，取樣固定.

1.2組織樣品制備和觀察

樣品切成1 cm×1 cm×0.6 cm組織塊，福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm.Masson三色染色(亮綠)，膠原纖維呈現(xiàn)藍綠色，細胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍色，紅細胞呈現(xiàn)紅色.Delafield 氏蘇木素-伊紅染色法進行常規(guī)結(jié)構(gòu)觀察.

1.3透射電鏡觀察

電鏡制片樣品切成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm組織塊，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液固定，丙酮乙醇梯度脫水，Epon812包埋，LKB8800型超薄切片機切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，日本JEM-100CX透射電子顯微鏡觀察照相.

1.4顯微結(jié)構(gòu)觀察

通過Olympus DP71 顯微照相系統(tǒng)，采用NIKON ECLIPSE 80i 型顯微攝像系統(tǒng)觀察、照相.

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個組織切片觀察隨機選取10個視野，用IPP圖像分析軟件測量leydig細胞數(shù)量及其面積.利用SPSS16.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,用LSD 法對平均數(shù)進行多重比較.

2結(jié)果與分析

2.1睪丸間質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)特征

光鏡下，1月齡羔羊睪丸leydig細胞體積較小，間質(zhì)內(nèi)血管和結(jié)締組織較少(圖1-A)；2月齡羔羊睪丸leydig細胞體積有所增大，血管內(nèi)皮細胞形成較為明顯管腔(圖1-B)；3月齡羔羊leydig細胞體積明顯增大，呈圓形或多邊形，胞核大而圓，有分泌性顆粒出現(xiàn)(圖1-C)；4月齡羔羊睪丸生精小管排列緊密，leydig細胞數(shù)量及其內(nèi)部分泌性顆粒增多(圖1-D)；5月齡羔羊睪丸生精小管排列密集，leydig細胞數(shù)量明顯增多，周圍出現(xiàn)巨噬細胞，生精小管間血管分布明顯(圖1-E)；6月齡羔羊睪丸相鄰3～4個生精小管間質(zhì)區(qū)形成明顯三角形，leydig細胞數(shù)量增多，成群密集分布(圖1-F).

藏綿羊羔羊睪丸間質(zhì)組織隨月齡增加結(jié)構(gòu)變化明顯.1，2月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)毛細血管分布較少，管壁內(nèi)皮細胞較圓，發(fā)育不完善(圖1-G)，周圍有散在的紡錘形或星形的幼稚成纖維細胞，結(jié)締組織分布較少(圖1-H)；3，4月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)血管內(nèi)皮細胞發(fā)育完善,巨噬細胞位于間質(zhì)血管周圍,細胞較大,形態(tài)不規(guī)則,結(jié)締組織有所增加(圖1-I,1-J)；5，6月齡羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)毛細血管數(shù)量增多，管壁內(nèi)皮細胞包圍成形，成纖維細胞呈長索狀，輪廓清楚，核仁大而明顯，結(jié)締組織明顯增加(圖1-K,1-L).

A：1月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；B：2月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；C：3月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；D：4月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；E：5月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；F：6月齡睪丸間質(zhì)，H.E染色，1000×；G：1月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×；H：2月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×；I：3月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×；J：4月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×；K：5月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×；L：6月齡睪丸間質(zhì)，Masson染色，1000×.↓：指示字母所標注的組織；Ley：leydig細胞；B：睪丸間質(zhì)血管.圖1　藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞光鏡下的結(jié)構(gòu)特征Fig.1　The structural features of Tibetan sheep lamb’s leydig cells under the light microscope

2.2睪丸leydig細胞超微結(jié)構(gòu)特征

電鏡下觀察，1月齡羔羊睪丸leydig細胞發(fā)育不成熟，體積較小，核內(nèi)染色質(zhì)含量較多，可見其胞漿內(nèi)含大量游離核糖體,胞質(zhì)較暗.間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)幼稚型血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞(圖2-A)；2月齡的羔羊睪丸leydig細胞體積有所增大，細胞數(shù)目增多，核著色深,線粒體明顯增多,含有豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及較多的脂滴,高爾基復(fù)合體也較發(fā)達,血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)明顯(圖2-B)；3月齡的羔羊睪丸leydig細胞體積明顯增大，可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿內(nèi)有少量分泌性顆粒出現(xiàn)(圖2-C)；4月齡的羔羊睪丸leydig細胞體積大，核仁明顯，分泌性顆粒增多(圖2-D)；5，6月齡的羔羊睪丸leydig細胞胞漿內(nèi)空泡及分泌性顆粒明顯增多，巨噬細胞明顯，毛細血管發(fā)育成熟，間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，分泌性顆粒明顯(圖2-E,2-F).

A：1月齡睪丸間質(zhì)，5000×；B：2月齡睪丸間質(zhì)，5000×；C：3月齡睪丸間質(zhì)，5000×；D：4月齡睪丸間質(zhì)，5000×；E：5月齡睪丸間質(zhì)，5000×；F：6月齡睪丸間質(zhì)，5000×.↓：指示字母所標注的組織；Ley ：leydig細胞；B：睪丸間質(zhì)血管；M：巨噬細胞；VEC：血管內(nèi)皮細胞；IF：成纖維細胞.圖2　藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞電鏡下的結(jié)構(gòu)特征Fig.2　The structural features of Tibetan sheep lamb’s leydig cells in the electron microscope

2.3睪丸leydig細胞形態(tài)計量學(xué)統(tǒng)計

統(tǒng)計表明，隨月齡的增加，藏綿羊羔羊睪丸大小發(fā)生明顯變化.leydig細胞數(shù)量逐漸增加，3月齡leydig細胞數(shù)量最多.4月齡及以后leydig細胞數(shù)量出現(xiàn)明顯下降.leydig細胞面積前5個月齡變化不大明顯，但6月齡顯著增大(P<0.05)，從5月齡的(33.79±4.74) μm2變化為6月齡的(55.33±8.71)μm2(表1，圖3).

3討論

哺乳動物睪丸leydig細胞的主要功能是分泌雄性激素并產(chǎn)生細胞調(diào)節(jié)因子.胚胎早期睪丸leydig細胞分泌的雄激素主要是誘導(dǎo)胚胎期性器官的分化和發(fā)育，而胎兒出生前后睪丸所分泌的雄激素主要是誘導(dǎo)中樞神系統(tǒng)中丘腦下部的性分化.動物發(fā)育至初情期，促性腺激素大量分泌期間，leydig細胞迅速增殖，此時分泌的雄性激素主要是促進第二性征的出現(xiàn)[5,6].劉慧雯等[7]報道大鼠睪丸leydig細胞發(fā)育存在兩個細胞增殖峰，分別在胚胎期17～19 d和生后4周.本研究中藏綿羊羔羊睪丸leydig細胞在3月齡之前數(shù)量不斷增加，5，6月齡時與3月齡無明顯差異；4月齡時leydig細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著增加，6月齡時leydig細胞數(shù)量變化不明顯，但是細胞面積增加顯著.表明3月齡之前睪丸leydig細胞處于增殖期，數(shù)量不斷增加；4月齡以后逐漸發(fā)育成熟，胞質(zhì)中出現(xiàn)分泌顆粒，為合成分泌雄性激素做準備.

表1　不同年齡藏綿羊羔羊睪丸間質(zhì)組織特征指數(shù)

同列肩標不同字母的表示差異顯著(P<0.05)，相同字母的表示差異不顯著(P>0.05).

圖3　不同年齡藏綿羊羔羊睪丸間質(zhì)組織特征指數(shù)Fig.3 　The organizational characteristic index ofTibetan Plateau Lamb testis

leydig細胞超微結(jié)構(gòu)變化在一定程度上反映了其功能狀態(tài).季節(jié)性發(fā)情動物在非繁殖季節(jié)leydig細胞脂質(zhì)蓄積，在胚胎或新生兒的leydig細胞中也會有脂質(zhì)蓄積，從青春期開始，睪丸leydig細胞受垂體前葉分泌的leydig細胞刺激，能合成分泌雄性激素，可促進精子發(fā)生和雄性生殖器官發(fā)育，以及維持第二性征和性功能[8].據(jù)Christ opher等[8]的研究報道，袋鼠leydig細胞的脂質(zhì)含量初生時增加，10 d后下降，60 d以后又出現(xiàn)增加，與其睪酮水平變化相一致.本研究中，4、5、6月份leydig細胞數(shù)量增加不明顯，但細胞面積變化顯著.與超微結(jié)構(gòu)觀察相一致，4月齡以后睪丸leydig細胞體積變大，核仁明顯，分泌性顆粒顯著增多，這與甘衛(wèi)東等[9]對人類睪丸早期發(fā)育階段leydig細胞的研究相一致.胚胎期和青春期時的leydig細胞胞漿內(nèi)常見脂質(zhì)蓄積，處于不斷發(fā)育中，雄性激素合成通路尚不具有活性.

研究表明，睪丸微循環(huán)擔(dān)負著氧、激素、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的供給和運輸任務(wù),并可依據(jù)睪丸的生理需求調(diào)節(jié)血流量,以維持其正常的生理機能.微血管分布于相鄰生精小管形成多角形的結(jié)締組織間隙.研究發(fā)現(xiàn)[10,12]，大鼠和人均是每3個生精小管圍成一個三角形的結(jié)締組織間隙，每個生精小管與6個生精小管相鄰.孫英等[11]研究表明，成年藏綿羊每3～4個生精小管圍成一個間隙，每個生精小管與5～8個生精小管相鄰.睪丸間質(zhì)微血管豐富，其對生精小管營養(yǎng)供應(yīng)更為充足.本研究中藏綿羊羔羊生精小管周圍的血管以及結(jié)締組織隨月齡增加逐漸發(fā)育.1月齡時生精小管之間沒有形成明顯的結(jié)締組織外形結(jié)構(gòu)，但到6月齡時已發(fā)育形成了三角形的間隙結(jié)構(gòu)，表明間質(zhì)結(jié)締組織內(nèi)微血管分布與生精小管發(fā)育有直接的關(guān)系.研究認為大鼠睪丸小葉單位面積內(nèi)微血管的數(shù)目與生精小管數(shù)目比值與生精小管的功能之間存在一定聯(lián)系[10,12].因此，本研究中，藏綿羊羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)的結(jié)締組織隨月齡的增加逐漸增多，間質(zhì)內(nèi)血管隨月齡的增加逐漸發(fā)育完善.藏綿羊羔羊睪丸間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織和血管的發(fā)育，一方面提示生精小管數(shù)量及管徑的相應(yīng)發(fā)育變化；另一方面也為leydig細胞的局部分泌調(diào)節(jié)提供支持.

哺乳動物睪丸間質(zhì)中的免疫活性細胞主要是巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞,它們參與免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)和組織重建,對睪丸穩(wěn)態(tài)具有重要作用.同時它們的功能和發(fā)育也受睪丸內(nèi)環(huán)境，尤其是睪丸leydig細胞和sertoli細胞的影響[13].睪丸中的巨噬細胞分布在生精小管管壁外層及間質(zhì)血管周圍,數(shù)量恒定，且與睪丸中l(wèi)eydig細胞數(shù)量成1∶4的固定比例.其常位于leydig細胞附近，leydig細胞突起伸入巨噬細胞表面的凹陷內(nèi)時可被其吞噬.活化的睪丸巨噬細胞對leydig細胞產(chǎn)生既有誘導(dǎo)又有抑制作用,當(dāng)巨噬細胞本身功能狀態(tài)發(fā)生改變,對leydig細胞功能的影響也隨之變化[14-15].本研究中，巨噬細胞明顯出現(xiàn)于5、6月齡羔羊睪丸間質(zhì)中，且在6月齡時其胞漿內(nèi)分泌顆粒明顯增加，表明其發(fā)育完善，為羔羊的進一步發(fā)育提供必要的免疫保障.

4結(jié)論

本研究表明，3月齡之前，藏綿羊羔羊leydig細胞處于胚胎型向成熟型過渡時期，數(shù)量不斷增加；4月齡以后逐漸發(fā)育成熟，為leydig細胞的局部分泌調(diào)節(jié)提供結(jié)構(gòu)支持，對生精小管的進一步發(fā)育以及后期精子發(fā)生具有重要意義.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Structure characteristics of leydig cell in Tibetan

sheep lamb at different ages

LU Yu-rong,YUAN Li-gang,WANG Xun,ZHANG Hui,GAN Li-peng,HUANG Ning,

YAN Zhen-long,CHEN Guo-juan,ZHANG Ji-wen

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：This experiment was conducted to investigate the structure characteristics of the Tibetan sheep lamb's leydig cells at different months.This study uses histochemistry and transmission electron microscope methods to characterize the microstructure and ultrastructure of the leydig cells in Tibetan sheep lamb's testis.The observations made with the light microscope were obvious morphological changes at different ages,the leydig cells were scattered in the interstitial connective tissue which were abundant with collagen between the seminiferous tubules,its development were inmature before 3-month-old and the numbers were increasing;although,the macrophages shaped irregularly were located near the interstitial blood vessel with the interstitial vascular endothelial cells were developed enough at 3～4 month old,after that,the lipid droplets in Leydig cells were appeared occasionally,the volume of leydig cells were not changed but interstitial tissues has further increased and abundant with collagen.The electron microscopic studies show that the leydig cells were oval with round shaped nuclei and many heterochromatin before 3-month-old,but the cell's volume changed more largely just development over 3-month old and appeared few secretory granules.In 4 month growth,the Leydig cells were irregularly shaped nuclei with prominent nucleoli,the vacuoles and secretory granules were present obviously,interstitial fibroblasts were long in shape and the blood vessels wall were surrounded by endothelial cells.Taken together,the leydig cells in the Tibetan sheep lamb's were in the transition period which developed from embryonal type to a mature stage before 3 months;but became gradually mature after that,the study providing the structural support for the local secretion of leydig cells,it is very important for the further development of seminiferous tubule and the late spermatogenesis.

Key words：Tibetan sheep lamb;testis;leydig cells;interstitial tissue

收稿日期：2014-12-10；修回日期：2015-03-16

基金項目：甘肅省2012年財政廳高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310733006).

通信作者：袁莉剛，女，教授，碩士導(dǎo)師，研究方向為動物發(fā)育生物學(xué).E-mail:yuan2918@126.com

中圖分類號：S 852.16+2

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)06-0012-06