路琪中,袁莉剛,呂亞楠,周福來,沈巖爾,王亭亭

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州　730070)

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Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛生精小管的定位及分布特征

路琪中,袁莉剛,呂亞楠,周福來,沈巖爾,王亭亭

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州730070)

摘要：采用H.E和Masson特殊染色以及免疫組織化學(xué)法結(jié)合形態(tài)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)成年牦牛(5～7歲)生精小管中的Ⅳ型膠原蛋白進(jìn)行定位，研究其分布特征.結(jié)果表明：睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)清晰,有4～8層細(xì)胞,膠原纖維分布于生精小管固有膜和間質(zhì)血管壁上；免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅳ型膠原蛋白在sertoli細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞及精子上呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞有陽(yáng)性表達(dá),生精小管基膜及管周肌樣細(xì)胞為弱陽(yáng)性表達(dá),而leydig細(xì)胞幾乎無表達(dá)；Ⅳ型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量在sertoli細(xì)胞及各級(jí)生精細(xì)胞顯著高于在leydig細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞中(P<0.05),但在固有膜和管周肌樣細(xì)胞之間的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P>0.01).Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸中的分布特征與膠原纖維分布相一致,sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞在合成及分泌Ⅳ型膠原蛋白中發(fā)揮作用.

關(guān)鍵詞：成年牦牛；睪丸；Ⅳ型膠原蛋白；免疫組織化學(xué)染色法

第一作者：路琪中(1993-),男,本科生，研究方向?yàn)閯?dòng)物發(fā)育生物學(xué).E-mail：1498647970@qq.com

哺乳動(dòng)物睪丸實(shí)質(zhì)組織包括生精小管和管周細(xì)胞間質(zhì)部分,含有很多細(xì)胞因子及其受體,在誘導(dǎo)生精細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變以及調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用方面具有十分重要的意義[1].研究表明膠原蛋白、層粘連蛋白(laminin,LN)、制動(dòng)素和蛋白多糖等是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分,它主要存在于動(dòng)物組織中,約占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%,Ⅳ型膠原蛋白(collagenⅣ)存在于所有器官的基膜中,形成結(jié)構(gòu)網(wǎng)架,使其具有韌性和通透性[2].據(jù)研究報(bào)道,Ⅳ型膠原蛋白具有調(diào)控細(xì)胞遷移、增值、分化和代謝的功能[3].研究認(rèn)為哺乳動(dòng)物睪丸sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞均能合成Ⅳ型膠原蛋白,參與構(gòu)成基底膜,對(duì)大分子蛋白等物質(zhì)具有選擇性透性[4].

牦牛生活在氣候寒冷、缺氧和低氣壓等生態(tài)環(huán)境下,其對(duì)環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力.研究表明,高原低氧環(huán)境下睪丸組織形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，其生精功能也會(huì)受到影響[5].Liao等[6]研究表明,缺氧對(duì)雄性牦牛生育能力的抑制不可忽視,睪丸局部血液循環(huán)中氧含量較低,可導(dǎo)致各種酶及蛋白降解能力降低,精子生成數(shù)量減少.研究表明,Ⅳ型膠原蛋白在牦牛犢牛sertoli細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),其在生精小管發(fā)育及基膜的構(gòu)建等方面發(fā)揮重要作用[7].目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于成年牦牛睪丸膠原蛋白的定位研究尚未見報(bào)道.因此,本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察成年牦牛生精小管Ⅳ型膠原蛋白的分布特點(diǎn),分析其生理特征與發(fā)育微環(huán)境的關(guān)系,旨在為高原哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)研究提供形態(tài)學(xué)參考.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

10、11月份在青海大通牧區(qū)通過外科去勢(shì)手術(shù)采集成年牦牛(5～7歲)睪丸10對(duì),取樣固定.

1.2主要藥品試劑

兔抗鼠Ⅳ型膠原蛋白多克隆抗體(bs-0806R,購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；免疫組化染色試劑盒(SP-9001,由美國(guó)ZYMED生產(chǎn),購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司).

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1組織樣品制備和觀察將組織樣品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小,4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚5 μm,蘇木精-伊紅(H.E)常規(guī)染色；Masson三色染色(亮綠),膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)綠色,細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色,紅細(xì)胞呈紅色.

1.3.2免疫組化染色采用免疫組化SP(streptavidin-perosidase)法進(jìn)行染色,石蠟切片常規(guī)脫蠟,酒精梯度分化；30 g/L H2O2水溶液封閉過氧化物酶10 min,正常山羊血清白蛋白孵育15 min后；每張切片滴加50 μL兔多克隆抗鼠Col Ⅳ-IgG (稀釋度1∶400),37 ℃孵育2 h,PBS振洗后每張切片滴加50 μL生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液,后加50 μL辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37 ℃孵育滴加新鮮配制DAB顯色液,常規(guī)脫水透明、封片.陰性對(duì)照以PBS替代兔源一抗進(jìn)行染色.

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2結(jié)果與分析

2.1睪丸組織顯微結(jié)構(gòu)特征

光鏡下,性成熟牦牛睪丸組織的生精小管生精上皮(spermatogenic epithelium)由4～8層生精細(xì)胞及sertoli細(xì)胞構(gòu)成,大量成熟的精子明顯分布于腔面,胞核呈長(zhǎng)索形的管周肌樣細(xì)胞圍繞于生精小管固有膜外周,leydig細(xì)胞成簇分布于間質(zhì)組織中(圖1-A,1-B)；間質(zhì)組織內(nèi)膠原纖維分布明顯,尤以生精小管固有膜較為豐富(圖1-C,1-D).

2.2Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織中的分布

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,睪丸生精小管基膜、sertoli細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞和精子中均顯示有Ⅳ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá),其中sertoli細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞及精子呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2-A,2-B),血管內(nèi)皮細(xì)胞有陽(yáng)性表達(dá),生精小管基膜及肌樣細(xì)胞為弱陽(yáng)性表達(dá),而leydig 細(xì)胞幾乎無表達(dá)(圖2-C),陰性對(duì)照無表達(dá)(圖2-D).

A,B:成年牦牛睪丸組織，HE染色,A標(biāo)尺示200 μm,B標(biāo)尺示20 μm；C,D：成年牦牛睪丸組織，Masson染色,C標(biāo)尺示100 μm,D標(biāo)尺示20 μm;ST:生精小管；CF：膠原纖維；SA：小血管.圖1　成年牦牛睪丸組織H.E染色及Masson染色Fig.1　H.E and Masson staning in adult yak testis

A:Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織中的表達(dá)，免疫組化染色,標(biāo)尺示100 μm；B：Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織中的表達(dá)，免疫組化染色,標(biāo)尺示20 μm；C： Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織中的表達(dá)，免疫組化染色,標(biāo)尺示10 μm；D：免疫組化染色陰性對(duì)照，標(biāo)尺示20 μm；▲：leydig細(xì)胞；↓：sertoli 細(xì)胞 ；：肌樣細(xì)胞；★：生精細(xì)胞；ST：生精小管；SA：小血管.圖2?、粜湍z原蛋白在成年牦牛睪丸免疫組織化學(xué)染色Fig.2　Immunohistochemical staning of collagen Ⅳ in adult yak testis

2.3Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織相對(duì)表達(dá)量分析

Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織免疫組化顯示,其在sertoli細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量為(7.96±0.65),在生精小管固有膜的相對(duì)表達(dá)量為(0.51±0.21)(P<0.01)，在管周肌樣細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量為(0.16±0.11)(P<0.05)；leydig細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量(0.08±0.05)顯著低于固有膜(0.15±0.21)和管周肌樣細(xì)胞(0.16±0.11)的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),但是在固有膜和管周肌樣細(xì)胞之間的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)(圖2-A,2-C,表1,圖3).陰性對(duì)照無表達(dá)(圖2-D).

表1　Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸的相對(duì)表達(dá)(n=30)

與sertoli細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量相比較,*表示差異顯著(P<0.05).

3討論與結(jié)論

睪丸生精小管由復(fù)雜的生精上皮和界線清楚的基膜構(gòu)成.生精小管間是富含淋巴管、血管、神經(jīng)和leydig細(xì)胞的疏松結(jié)締組織.生精上皮主要由生精細(xì)胞和sertoli細(xì)胞組成,不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞可排列成4～8層,逐步發(fā)育形成精子[8].高寒低氧地區(qū),公牦牛在3 歲進(jìn)入繁殖群配種期,配種年齡為4～8 歲,生殖能力較強(qiáng),8、9歲以后逐漸老齡化,繁殖能力迅速減退[9].朱俊峰等[10]研究表明,3歲牦牛生精小管密集、發(fā)育充分,外直徑增加明顯,上皮細(xì)胞層數(shù)達(dá)到最大值.睪丸間質(zhì)結(jié)締組織含量的增加會(huì)引起睪丸組織纖維化,影響睪丸leydig細(xì)胞分泌產(chǎn)物的輸送,進(jìn)而影響其對(duì)睪丸生精功能的調(diào)控[11].本研究中5～7歲性成熟牦牛睪丸生精小管結(jié)構(gòu)清楚,復(fù)層上皮分層明顯,表明其發(fā)育良好,間質(zhì)結(jié)締組織含量對(duì)睪丸功能無明顯影響.

睪丸sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞在產(chǎn)生和形成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)時(shí)互相合作且均能合成Ⅳ型膠原蛋白,參與形成固有膜[12-14].研究報(bào)道,Ⅳ型膠原蛋白和LN沿上皮基膜和圍繞管周肌樣細(xì)胞、sertoli細(xì)胞分布,LN及Ⅳ型膠原蛋白在管周肌樣細(xì)胞發(fā)育時(shí)出現(xiàn),且在sertoli細(xì)胞分化以及維持分化的各個(gè)階段發(fā)揮功能[15].本研究中Ⅳ型膠原蛋白在生精小管基膜和肌樣細(xì)胞均有表達(dá),在sertoli相對(duì)表達(dá)量為(7.96±0.65),為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；管周肌樣細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量為(0.16±0.11),與sertoli細(xì)胞相比差異顯著.Scott等[4]研究表明，Ⅳ型膠原蛋白在犬的生精小管基膜呈陽(yáng)性表達(dá),表明sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞相互合作在合成及分泌Ⅳ型膠原蛋白中發(fā)揮作用.此結(jié)果與本研究結(jié)果相一致,提示牦牛睪丸sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞與合成Ⅳ型膠原蛋白密切相關(guān).

楊芳等[16]研究表明,Ⅳ型膠原蛋白在正常細(xì)胞的發(fā)育、分化、粘附、運(yùn)動(dòng)等生理功能中發(fā)揮重要作用.楊政[17]研究發(fā)現(xiàn),Ⅳ型膠原蛋白可由活化的腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等合成和分泌,參與腎臟生理功能的調(diào)節(jié).研究表明,Ⅳ型膠原蛋白在牦牛犢牛睪丸間質(zhì)內(nèi)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),在生殖母細(xì)胞有絲分裂階段無表達(dá)；提示Ⅳ型膠原蛋白可以促進(jìn)生殖母細(xì)胞從管壁移向管腔，但并不參與其分化與成熟過程[7].本研究中Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸組織各級(jí)生精細(xì)胞及精子呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),與Glattauer等[18]在牛睪丸組織中Ⅳ型膠原蛋白主要存在于基膜及生精細(xì)胞的結(jié)果相一致，其認(rèn)為牛生精細(xì)胞亦可產(chǎn)生Ⅳ型膠原蛋白，但是關(guān)于牦牛生精細(xì)胞是否可產(chǎn)生Ⅳ型膠原蛋白還有待于進(jìn)一步研究.

因此,Ⅳ型膠原蛋白在成年牦牛睪丸中的分布特征與膠原纖維分布相一致,sertoli細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞在合成及分泌Ⅳ型膠原蛋白中發(fā)揮作用.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Distribution characteristic of collagen Ⅳ in

adult yak testis

LU Qi-zhong,YUAN Li-gang,LYU Ya-nan,ZHOU Fu-lai,SHEN Yan-er,WANG Ting-ting

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In order to clearly understand the distribution of collagen Ⅳ(Col Ⅳ)in adult yak testis (5～7 years old),this report provided a detailed description about the distribution of collagen Ⅳ by the methods of paraffin section stained with hematoxylin and eosin,Masson's trichrome and immunohistochemistry.The results showed that the morphological structure was obvious clear at the light microscope,there were 4～8 layers cell in spermatogenic epithelium,and abundant collagen fiber in the adult yak seminiferous basement and blood capillary.The strong immunoreactivity of collagen Ⅳ was seen in Sertoli cells,spermatogenic cells,spermatozoa and vascular endothelial cells,collagen Ⅳ were weakly present throughout the basement membranes (BM) and peritubular myoid cells in seminiferous tubule,but no expression in leydig cells.The statistical dates indicated that the relative expression of collagen Ⅳ in Sertoli cells and spermatogenic cells was significantly higher than leydig cells and peritubular myoid cells (P<0.05),but collagen Ⅳ were weakly present expression between the BM and peritubular myoid cells (P>0.01).In conclusion,the distribution of collagen Ⅳ was consistent with collagen fiber in adult yak testis.The Sertoli cells and peritubular myoid cells were the main causes for the secretion of collagen Ⅳ,could serve as a meaningful index for the further research of the yak testis plateau adaption function.

Key words：adult yak;testis;collagen Ⅳ;immunohistochemistry

收稿日期：2014-12-08；修回日期：2015-03-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160488)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(20140317).

通信作者：袁莉剛(1974-),女,博士,教授,研究方向?yàn)閯?dòng)物解剖學(xué)、組織胚胎學(xué)及動(dòng)物發(fā)育生物學(xué).E-mail：yuan2918@126.com

中圖分類號(hào)：S852.16+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2015)06-0001-05