劉 奔，郭鵬榮，盛玉文，傅德望，王成財，王 朝

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·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

靈芝多糖對荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠化療后腹腔巨噬細(xì)胞的影響及相關(guān)免疫機(jī)制研究

劉 奔，郭鵬榮，盛玉文，傅德望，王成財，王 朝

目的 探討靈芝多糖對荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠化療后腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。方法 2012年5月—2014年10月建立荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠模型15只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：0.9%氯化鈉溶液組、順鉑組、順鉑+靈芝多糖組，每組5只。分別以0.9%氯化鈉溶液、0.9%氯化鈉溶液、靈芝多糖灌胃18 d，以0.9%氯化鈉溶液、順鉑、順鉑腹腔注射5 d。收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測腹腔巨噬細(xì)胞對異硫氰酸熒光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的吞噬能力，以FITC-dexran陽性率表示；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測腹腔巨噬細(xì)胞白介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)水平；采用熒光定量PCR(RT-PCR)檢測腹腔巨噬細(xì)胞IL-1 mRNA和TNF-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 順鉑+靈芝多糖組小鼠FITC-dextran陽性率較順鉑組升高4.5%；順鉑+靈芝多糖組小鼠CD11b-FITC陽性率和CD68-FITC陽性率分別較順鉑組升高11.5%和13.4%，但均未能達(dá)到0.9%氯化鈉溶液組巨噬細(xì)胞中陽性率。3組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-α表達(dá)水平及IL-1 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中順鉑組和順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-α表達(dá)水平及IL-1 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平較0.9%氯化鈉溶液組降低(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-α表達(dá)水平及IL-1 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平較順鉑組升高(P<0.05)。結(jié)論 靈芝多糖能夠提高荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而提高機(jī)體的免疫功能，其機(jī)制可能與增強(qiáng)IL-1和TNF-α的表達(dá)水平有關(guān)。

膀胱腫瘤；靈芝；抗腫瘤聯(lián)合化療方案；巨噬細(xì)胞

劉奔，郭鵬榮，盛玉文，等.靈芝多糖對荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠化療后腹腔巨噬細(xì)胞的影響及相關(guān)免疫機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2971-2975.[www.chinagp.net]

Liu B,Guo PR,Sheng YW,et al.Effects of ganoderma lucidum polysaccharides on peritoneal macrophages in nude mice bearing human ladder cancer T24 cells after chemotherapy and related immune mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2971-2975.

靈芝多糖是從靈芝孢子體中提取的有效成分。有研究表明，靈芝多糖灌胃給藥具有增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力[1]，促進(jìn)脾臟及外周血淋巴細(xì)胞增生,近一步活化T淋巴細(xì)胞，提高免疫應(yīng)答能力，并且能夠促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素(IL)的表達(dá)，具有增強(qiáng)免疫抑制和抗腫瘤作用[2]。本實驗研究其對小鼠化療后腹腔巨噬細(xì)胞的影響及相關(guān)表達(dá)，探討靈芝多糖影響免疫逃逸的初步機(jī)制，深入研究傳統(tǒng)中藥對惡性腫瘤的免疫機(jī)制及治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 2012年5月—2014年10月，人源膀胱癌T24細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞庫。Balb/c小鼠15只，4～6周齡，雌性，購于北京華阜康生物科技股份有限公司(動物合格證號：SCXK京2009-0004)。

1.2 實驗藥物及試劑 靈芝多糖選用杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的靈芝多糖粉，用 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解，并稀釋至實驗濃度。順鉑注射液購于山東齊魯制藥有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：SH30809.01)、胎牛血清(批號：V30087.01)、胰蛋白酶(批號：SH30042.01)均購于美國 hyclone公司。異硫氰酸熒光素-右旋糖酐(FITC-dextran)、IL-1、TNF-α購于美國 Sigma公司。目的基因IL-1和TNF-α引物和內(nèi)參基因β-actin引物由天根生化科技(北京)有限公司合成。小鼠IL-1定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司(進(jìn)口分裝)；RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC)(批號：1609-47-8)購于上海思域化工科技有限公司，RNA提取試劑盒TRIzol、RNA酶抑制劑、EcoRⅠ限制酶、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)均購于美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄Taq DNA聚合酶購于日本Takara公司。

1.3 荷瘤鼠的建立及分組 取對數(shù)生長期人源膀胱癌T24細(xì)胞，調(diào)至細(xì)胞濃度2.0×106個/ml，懸于200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下。待小鼠體表腫瘤長至長徑4～5 mm時，為荷瘤成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將荷瘤鼠平均分為3組：0.9%氯化鈉溶液組、順鉑組、順鉑+靈芝多糖組，每組5只。分別以0.9%氯化鈉溶液、0.9%氯化鈉溶液、靈芝多糖(200 mg/kg)灌胃18 d，以0.9%氯化鈉溶液、順鉑(25 mg/kg)、順鉑(25 mg/kg)腹腔注射5 d。

1.4 腹腔巨噬細(xì)胞的收集及培養(yǎng) 于實驗第19天在SPF實驗室操作臺按動物福利學(xué)將小鼠脫頸斷頭處死，向腹腔注入Hanks液5 ml，輕揉擠壓腹部，吸出灌洗液。將灌洗液以1 300 r/min離心5 min(離心半徑3.0 cm)，棄去上清液，用Hanks液洗滌3次，合并小鼠細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，配制濃度為2×106/ml，將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，1 ml/孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使巨噬細(xì)胞貼壁，棄去上清液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗3遍，除去非黏附細(xì)胞，即為巨噬細(xì)胞。調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106個/ml，同時進(jìn)行細(xì)胞活力的觀察及巨噬細(xì)胞的鑒定，接種于培養(yǎng)板內(nèi)，放入37.5 ℃，20%CO2培養(yǎng)箱2～3 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞。

1.5 巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定 將培養(yǎng)好的巨噬細(xì)胞沖液、懸浮計數(shù)，使其調(diào)整至濃度為1×106個/ml。分別取150 μl細(xì)胞懸液，加入濃度為1 mg/ml的FITC-dextran，同時另做陰性對照，加入150 μl PBS。配置好的細(xì)胞懸液置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h待用。取出后用PBS沖洗至細(xì)胞懸浮，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。檢測FITC-dextran陽性率，表示巨噬細(xì)胞的吞噬能力。檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Cell Quest軟件計算所得。

1.6 檢測腹腔巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α表達(dá)水平及其mRNA 表達(dá)水平 24 孔板內(nèi)每孔加入500 μl待測巨噬細(xì)胞，調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106個/ml，并加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液補(bǔ)充至1 000 μl/孔,每個終濃度設(shè)3個復(fù)孔,并設(shè)空白對照孔(只含RPMI 1640培養(yǎng)液)。在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 d后，分別吸取上清液，按照小鼠ELISA試劑盒說明書分別檢測巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α表達(dá)水平。

按RNA提取試劑盒TRIzol說明書提取腹腔巨噬細(xì)胞 RNA。將所提RNA依次經(jīng)RNA酶抑制劑DEPC 50 μl溶解，同時取5 μl用于檢測RNA的完整性。取上述RNA溶液10 μl，首先按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后，以cDNA為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。IL-1上游引物為：5′-GAGCACCTTCTTTTCCTTCATCTT-3′，下游引物為 5′-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3′；TNF-α上游引物為：5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，下游引物為 5′-ACCGCCTGGAGGTTGGAA-3′。擴(kuò)增引物和TaqMan由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計。以上述cDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為50 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán)反應(yīng)；最后72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行PCR產(chǎn)物條帶掃描，以β-actin作為熒光定量PCR(RT-PCR)的鑒定、測序，分別計算 IL-1、TNF-α mRNA與其對應(yīng)的β-actin峰面積的比值，即為相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞的吞噬能力 順鉑+靈芝多糖組小鼠FITC-dextran陽性率較順鉑組升高4.5%。順鉑+靈芝多糖組小鼠CD11b-FITC陽性率和CD68-FITC陽性率分別較順鉑組升高11.5%和13.4%，但均未能達(dá)到0.9%氯化鈉溶液組巨噬細(xì)胞中陽性率(見圖1)。

注：FITC-dextran=異硫氰酸熒光素-右旋糖酐

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力變化

Figure 1 The change of phagocytosis in peritoneal macrophages of mice

2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1及TNF-α表達(dá)水平比較 3組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1及TNF-α表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中順鉑組和順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1及TNF-α表達(dá)水平較0.9%氯化鈉溶液組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1及TNF-α表達(dá)水平較順鉑組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of the expression levels of IL-1 and TNF-α in peritoneal macrophages among each group of mice

組別例數(shù)IL-1TNF-α0.9%氯化鈉溶液組556.67±7.6475.00±7.21順鉑組525.33±2.89a38.33±5.13a順鉑+靈芝多糖組541.00±4.00ab56.00±5.00abF值26.7229.29P值0.0010.008

注：IL-1=白介素1，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與0.9%氯化鈉溶液組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05

2.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1 mRNA和TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 3組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1 mRNA及TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中順鉑組和順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1 mRNA及TNF-α mRNA表達(dá)水平較0.9%氯化鈉溶液組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1 mRNA及TNF-α mRNA表達(dá)水平較順鉑組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table 2 Comparison of the expression levels of IL-1 mRNA and TNF-α mRNA in peritoneal macrophages among each group of mice

組別例數(shù)IL-1mRNATNF-αmRNA0.9%氯化鈉溶液組51.00±0.101.00±0.20順鉑組50.35±0.06a0.30±0.04a順鉑+靈芝多糖組50.79±0.06ab0.68±0.42abF值57.6025.52P值<0.0010.001

注：與0.9%氯化鈉溶液組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要功能。其免疫效應(yīng)主要以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起重要作用。研究表明，巨噬細(xì)胞通過釋放 NO、IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α等增加表面分子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，提高機(jī)體免疫力，殺傷腫瘤細(xì)胞[3]。TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫調(diào)節(jié)和前炎性因子，可以促使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)因子，促進(jìn)抗炎反應(yīng)，還可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無明顯殺傷作用，同時也是一種內(nèi)生致熱源，引起主要血管擴(kuò)張。IL-1與TNF-α相比，IL-1的細(xì)胞毒作用較弱，而特異性免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)。有研究表明，IL-1可以殺傷人的黑色素瘤細(xì)胞，還能促使小鼠胸腺瘤細(xì)胞的凋亡[4]。目前，臨床應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物均有不同程度的毒副作用，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，又殺傷正常組織細(xì)胞和器官，使機(jī)體功能出現(xiàn)不同程度的損害，胃腸道反應(yīng)、皮膚病損、血液病變等[5]。當(dāng)長期大劑量應(yīng)用后最主要是致使免疫力降低及抵抗外來侵入的能力降低，體質(zhì)極度削弱。

傳統(tǒng)中草藥黃芪、蒲公英、當(dāng)歸、益母草等制成的灌胃液(高劑量1 ml·只-1·d-1)能明顯提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力[6]。Dai等[7]研究證明，甘草多糖可以增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，提高非特異免疫功能，同時具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗感染等作用[8]。亮菌多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α和NO的表達(dá)水平,增強(qiáng)IL-1β、IL-6、TNF-α和NO合成關(guān)鍵酶一氧化氮合酶(NOS)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫力，殺傷腫瘤細(xì)胞[9]。張莘莘等[10]研究證明了，黑靈芝多糖可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活化能力，并且可以釋放相關(guān)免疫因子如IL-1β、NO、TNF-α等，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力。實驗研究通過小鼠靈芝多糖灌胃，腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液后，觀察得到巨噬細(xì)胞能顯著提高對雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)[1]。另有研究表明，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)水平與靈芝多糖的濃度呈依賴性[11]。

盡管惡性腫瘤在治療、臨床試驗效果均不理想，其原因與應(yīng)用相關(guān)化療藥物所致毒副作用相關(guān)。中藥在提高機(jī)體免疫力方面具有優(yōu)勢，啟發(fā)在中藥提取物中尋找有效的成分提高免疫力能協(xié)調(diào)化療藥物抗腫瘤。本研究結(jié)果顯示,靈芝多糖能通過活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬作用，順鉑+靈芝多糖組巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α表達(dá)水平較順鉑組升高，說明靈芝多糖能高機(jī)體的免疫力和協(xié)同順鉑抗腫瘤能力，抑制腫瘤細(xì)胞生長,發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究僅探討巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α的表達(dá)水平，而其他相關(guān)免疫因子的表達(dá)水平和免疫機(jī)制以及靈芝多糖對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響需進(jìn)一步研究。

綜上所述，目前針對惡性腫瘤治療,由于化療后出現(xiàn)毒副作用,致使腫瘤治療失敗[12-14]。因此，研究靈芝多糖對巨噬細(xì)胞的激活作用,提高機(jī)體免疫力,以整合醫(yī)學(xué)為指導(dǎo),配合化療藥物治療膀胱癌有望為惡性腫瘤的治療提供一條新的有效方法，為解決臨床實際問題提供理論依據(jù)，推動祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論以及應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，并為調(diào)控腫瘤免疫提供新的思路，具有潛在的應(yīng)用前景。

利益沖突聲明：本課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。無利益沖突。

倫理要求：實驗大鼠符合動物福利和倫理，實驗方案獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

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(本文編輯：陳素芳)

Effects of Ganoderma Lucidum Polysaccharides on Peritoneal Macrophages in Nude Mice Bearing Human Ladder Cancer T24 Cells After Chemotherapy and Related Immune Mechanism

LIUBen,GUOPeng-rong,SHENGYu-wen,etal.

DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity，Jinzhou121001,China

Objective To explore the effects of ganoderma lucidum polysaccharides(GLP) on the immune function of macrophages in mice bearing human ladder cancer T24 cells.Methods Nude mice model bearing the human bladder cancer T24 cells was established from May 2012 to October 2014,mice were divided into three groups by random number table method:0.9% sodium chloride solution group,cisplatin group and cisplatin+GLP group,there were 5 mice in each group.Mice in the above three groups received intragastric administration of 0.9% sodium chloride solution,0.9% sodium chloride solution and GLP,respectively,and received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution,cisplatin and cisplatin,respectively.The peritoneal macrophages were then collected,the phagocytic rate of peritoneal macrophages against FITC-dextran was further detected by flow cytometry，the levels of IL-1 and TNF-α in peritoneal macrophages were measured by ELISA，and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was used to analyze the mRNA levels of IL-1 and TNF-α in peritoneal macrophages.Results The positive rates of FITC-dextran,CD11b-FITC and CD68-FITC among mice in cisplatin+GLP group were 4.5%,11.5% and 13.4% higher than those among mice in cisplatin group,respectively,the above indicators among mice in cisplatin+GLP group and cisplatin group were lower than those among mice in 0.9% sodium chloride solution group,respectively.There were significant differences in levels of IL-1 and TNF-α,expression levels of IL-1 mRNA and TNF-α mRNA in peritoneal macrophages among three groups of mice (P<0.05);levels of IL-1 and TNF-α,expression levels of IL-1 mRNA and TNF-α mRNA in peritoneal macrophages among mice in cisplatin+GLP group and cisplatin group were significantly lower than those among mice in 0.9% sodium chloride solution group,respectively (P<0.05);the above indicators among mice in cisplatin+GLP group were significantly higher than those among mice in cisplatin group (P<0.05).Conclusion GLP could improve the phagocytic function of peritoneal macrophages in mice,thus can improve immune function of body,the mechanism of which may be related to the enhancement effect of GLP on IL-1 and TNF-α expression levels.

Urinary bladder neoplasms；Ganoderma lucidum；Antineoplastic combined chemotherapy protocols；Macrophages

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目 (201202131)

121001遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科

劉奔，121001遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科；E-mail：doctor_liuben@163.com

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.020

2014-10-14；

2015-03-20)