郭 硯，孫 娟，王麗雯

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·論著·

藏雪蓮水提取物對中波紅斑效應紫外線輻射后人角質形成細胞中蛋白表達的影響研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

目的 探討藏雪蓮水提取物對中波紅斑效應紫外線(UVB)輻射后人角質形成細胞(HaCaT細胞)中白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達水平。方法 體外培養(yǎng)HaCaT細胞，采用隨機數(shù)字表法分為3組，對照組、UVB輻射組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h)、藏雪蓮水提取物組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h+藏雪蓮 5 g/L)，藏雪蓮水提取物于UVB輻射前1 h加入細胞培養(yǎng)基中，輻射后18 h，收集細胞，采用臺盼藍染色觀察細胞形態(tài)，檢測HaCaT細胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平。結果 臺盼藍染色顯示，UVB輻射組與對照組比較，HaCaT細胞藍染數(shù)量增加，并出現(xiàn)腫脹、細胞漂浮，但仍可看出細胞形態(tài)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細胞藍染數(shù)量下降，細胞水腫程度減輕，并且細胞形態(tài)接近對照組。UVB輻射組與對照組比較，HaCaT細胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平升高，Bcl-2表達水平降低(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平降低，Bcl-2表達水平升高(P<0.05)。結論 藏雪蓮水提取物能夠降低UVB輻射后HaCaT細胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平，升高 Bcl-2表達水平。

紫外線；輻射；藏雪蓮；角質形成細胞；白介素6；腫瘤壞死因子α

郭硯，孫娟，王麗雯.藏雪蓮水提取物對中波紅斑效應紫外線輻射后人角質形成細胞中蛋白表達的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(24)：2929-2933.[www.chinagp.net]

Guo Y,Sun J,Wang LW.Influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip water extracts on the protein expression of HaCaT cells after UVB radiation[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2929-2933.

藏雪蓮絕大部分產于我國青藏高原及其毗鄰地區(qū),屬菊科鳳毛菊屬雪蓮亞屬草本植物，是傳統(tǒng)珍貴藏藥，含有揮發(fā)油、生物堿、甾醇、黃酮類、酚類、糖類、鞣質原糖和16種氨基酸、雪蓮內酯以及鉀、鈣、鋅、鐵、鎂等元素,具有較高的營養(yǎng)價值。中波紅斑效應紫外線(UVB)(280～319 nm)輻射損傷是引起皮膚光老化最重要的因素，主要損傷皮膚角質形成細胞(HaCaT細胞)。已有研究證實，UVB輻射后可升高白介素6(IL-6)[1]、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[2],降低線粒體膜電位并升高細胞內游離Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，抑制B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)的表達[7]，進而引起半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級聯(lián)反應，引起細胞凋亡[8]。藏雪蓮水提取物5 g/L能夠減輕UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷[9]，但關于p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Caspase-3表達尚未見報道。故本研究觀察藏雪蓮水提取物對UVB輻射后HaCaT細胞中IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，探討其減輕輻射損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 藏雪蓮購自青海眾康醫(yī)藥連鎖有限公司，HaCaT細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；10%胎牛血清(FBS)購自Biological Industries，DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，胰酶購自Solarbio公司，臺盼藍染色液購自美國Sigma生物公司，IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒及TNF-α ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；人p38MAPK酶聯(lián)免疫試劑盒、人p53酶聯(lián)免疫試劑盒、人Bcl-2酶聯(lián)免疫試劑盒、人Bax酶聯(lián)免疫試劑盒、人Caspase-3酶聯(lián)免疫試劑盒均購自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱購自上海力申科學儀器有限公司,IX71型Olympus倒置顯微鏡購自Olympus,飛利浦TL 20 W/12紫外線UVB燈管購自上海杰圖商貿有限公司，UV-340A UVB輻照度監(jiān)示器購自北京精密儀器科技有限公司，X-Mark型bio-rad酶標儀購自Bio-Rad公司，手持勻漿儀購自無錫沃信儀器有限公司,恒溫混勻儀TS-100購自杭州瑞誠儀器有限公司。

1.2 藏雪蓮水提取物的提取 根據(jù)文獻[10]，準確稱取100 g藏雪蓮(藏雪蓮經(jīng)青海大學醫(yī)學院藥學系陳湘宏副教授鑒定)，加入蒸餾水浸泡過夜(料液比為1∶5)，加熱至100 ℃后，文火(85 ℃)煎煮2 h，每隔15 min攪拌1次，過濾，濾渣加蒸餾水后繼續(xù)煎煮，重復3次，過濾，合并濾液，冷凍干燥得到藏雪蓮水提取物。以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基為溶劑，配置成藏雪蓮水提取物5 g/L，并用0.22 μm孔徑過濾器過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 HaCaT細胞的培養(yǎng) 根據(jù)文獻[11]，HaCaT細胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(內含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素)，接種于培養(yǎng)瓶后，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱，當細胞達90%融合時傳代，取處于對數(shù)生長期3～5代的細胞用于實驗。

1.4 實驗分組 當HaCaT細胞達到85%～90%融合時，將培養(yǎng)瓶內的細胞按1×106ml細胞濃度傳到96孔板及6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞達80%～90%融合時，采用隨機數(shù)字表法分為3組，對照組、UVB輻射組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h)、藏雪蓮水提取物組(UVB 30 mJ/cm2，輻射1 h+藏雪蓮 5 g/L)。UVB輻射前1 h將HaCaT細胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，并將藏雪蓮水提取物加入培養(yǎng)基中，對照組用錫紙包住置暗處，UVB輻射組和藏雪蓮水提取物組打開培養(yǎng)皿蓋，在預設好的UVB輻射儀中照射1 h，立即用無菌PBS洗滌3遍，并加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 臺盼藍染色 將含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的96孔板，無菌PBS洗滌3遍，各組細胞中每孔加入0.4%臺盼藍染色液50 μl，3 min，IX71型Olympus倒置顯微鏡照相系統(tǒng)觀察并攝片。

1.5.2 IL-6、TNF-α表達水平檢測 貼壁細胞用胰液消化，手持勻漿儀裂解細胞，1 500×g離心10min后，吸取上清液，將100 μl不同濃度的標準品(0～100 pg/ml IL-6、0～1 000 pg/ml TNF-α)及樣本(各組細胞的上清液)加入酶標板，覆膜后37 ℃溫育2 h，棄去液體甩干，每孔加A工作液(IL-6、TNF-α ELISA試劑盒內配備)100 μl，覆膜后37 ℃溫育1 h，棄去液體，洗板機洗板3次，甩干后每孔加B工作液(IL-6、TNF-α ELISA試劑盒內配備)100 μl，覆膜后37 ℃溫育30 min，棄去液體，洗板機洗板5次，甩干后每孔加底物溶液90 μl，覆膜后37 ℃避光顯色15～25 min，每孔加終止溶液50 μl，于酶標儀450 nm波長處測量各孔的吸光度并記錄結果，每組單獨重復測量5次。實驗步驟按照IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書進行。

1.5.3 p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平檢測 貼壁細胞用胰液消化，手持勻漿儀裂解細胞，1 500×g離心10 min，吸取上清液，除空白孔外，標準品孔和樣品孔分別加入標準品(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3)和樣品(各組細胞的上清液)50 μl，加入酶標試劑50 μl，覆膜后37 ℃孵育1 h，棄去液體，洗板機洗板5次，每孔加入顯色試劑A、顯色試劑B(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3試劑盒內配備)各50 μl，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μl，以空白孔調零后，酶標儀450 nm波長測定各孔吸光度并記錄結果。每組單獨重復5次。實驗步驟按照p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 臺盼藍染色結果 UVB輻射組與對照組比較，HaCaT細胞藍染數(shù)量增加，并出現(xiàn)腫脹、細胞漂浮，但仍可看出細胞形態(tài)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，HaCaT細胞藍染數(shù)量下降，細胞水腫程度減輕，并且細胞形態(tài)接近對照組(見圖1)。

2.2 3組HaCaT細胞IL-6、TNF-α表達水平比較 3組HaCaT細胞IL-6、TNF-α表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中UVB輻射組與對照組比較HaCaT細胞IL-6、TNF-α表達水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較HaCaT細胞IL-6、TNF-α表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 3組HaCaT細胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平比較 3組HaCaT細胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中UVB輻射組與對照組比較HaCaT細胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平升高,Bcl-2表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較HaCaT細胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平降低,Bcl-2表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

3 討論

青藏高原具有高海拔、強紫外線和缺氧的地理環(huán)境，居住人群長期暴露于強紫外線中，導致皮膚光老化，引發(fā)多種皮膚疾病,尤其表現(xiàn)在皮膚UVB損傷和皮膚癌發(fā)病率不斷增加。而藏雪蓮是最負盛名的高山植物之一，性辛熱,有“通經(jīng)活血，祛風勝濕”和暖宮散疹等功效,具有散寒除濕、壯陽補血、抗炎鎮(zhèn)痛、延緩衰老等作用[12-13]。

UVB損傷皮膚角質形成細胞是引起皮膚光老化的最重要因素。既往研究證實，UVB輻射后可升高IL-6[1]、TNF-α[2],降低線粒體膜電位，升高細胞內游離Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，活化下游p53，特異地降低Bcl-2的表達水平[7]，提高Bax的表達水平，進而引起Caspase級聯(lián)反應，引起細胞凋亡[8]。但目前為止，藏雪蓮水提取物能否通過降低IL-6、TNF-α表達水平，降低UVB輻射后HaCaT細胞的炎癥損傷以及通過降低p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3，升高Bcl-2，減輕UVB輻射后HaCaT細胞凋亡，進而減輕HaCaT細胞形態(tài)學變化的文獻尚未見報道。因此，本研究主要通過臺盼藍染色觀察UVB輻射后HaCaT細胞的形態(tài)學變化，并通過觀察UVB輻射HaCaT細胞中炎性因子(IL-6、TNF-α)及凋亡相關因子(p38MAPK、p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表達情況，來探討藏雪蓮水提取物能否通過降低炎性因子及凋亡因子來減輕UVB輻射后HaCaT細胞的形態(tài)學變化，進而減輕UVB輻射對HaCaT細胞的輻射損傷。

Table 1 Comparison of the expression level of IL-6 and TNF-α of HaCaT cells among the three groups

組別IL-6TNF-α對照組15.77±1.0832.59±1.56UVB輻射組27.46±0.48a79.97±2.96a藏雪蓮水提取物組21.66±0.88b37.12±1.39bF值282.24981.52P值<0.001<0.001

注：UVB=中波紅斑效應紫外線，IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與對照組比較，aP<0.05；與UVB輻射組比較，bP<0.05

UVB=中波紅斑效應紫外線

圖1 3組HaCaT細胞臺盼藍染色結果(×10)

注：p38MAPK=p38絲裂原活化蛋白激酶,Bcl-2=B細胞淋巴瘤因子2,Bax=Bcl-2相關X蛋白,Caspase-3=半胱氨酸蛋白酶3；與對照組比較，aP<0.05；與UVB輻射組比較，bP<0.05

本研究結果表明，HaCaT細胞經(jīng)UVB照射后，出現(xiàn)輕度腫脹、漂浮，且臺盼藍藍染細胞數(shù)量增加，但細胞形態(tài)仍可看出，藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，細胞形態(tài)明顯恢復，藍染細胞數(shù)量明顯下降，細胞死亡碎片及脫片現(xiàn)象明顯改善；UVB輻射組與對照組比較，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平上升，Bcl-2表達水平下降，藏雪蓮水提取物組與UVB輻射組比較，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平下降，Bcl-2表達水平上升。說明藏雪蓮水提取物能夠通過降低UVB輻射后炎性因子及凋亡因子的表達來減輕HaCaT細胞的輻射損傷。

本研究結果證實，藏雪蓮水提取物能夠降低HaCaT細胞經(jīng)UVB輻射后IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表達水平，升高Bcl-2表達水平，減輕UVB輻射后HaCaT細胞炎性因子及凋亡因子的表達，進而減輕UVB輻射后HaCaT細胞的輻射損傷，并為進一步探討藏雪蓮水提取物在UVB光保護作用的機制提供理論基礎。

利益沖突聲明：本課題未涉及任何廠家及相關雇主或其他經(jīng)濟組織直接或間接的經(jīng)濟或利益的贊助。無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Influence of Saussurea Tridactyla Sch-Bip Water Extracts on the Protein Expression of HaCaT Cells After UVB Radiation

GUOYan,SUNJuan,WANGLi-wen.

DepartmentofSkinDiseaseandVenerealDivision，AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China

Objective To investigate the influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip (SSB) water extract on the expressions of interleukin 6 (IL-6),tumor necrosis factor alpha (TNF-α),p38 mitogen activated protein kinase (p38MAPK),p53,B cell lymphoma factor 2 (Bcl-2),Bcl-2 associated X protein (Bax),cysteine proteinase 3 (Caspase-3) in HaCaT cell after medium wave ultraviolet erythema effect of ultraviolet rays (UVB) radiation.Methods HaCaT cells were cultured in vitro and randomly divided into 3 groups:control group,UVB radiation group (30 mJ/cm2,radiation 1 h,UVB group),UVB+SSB group (UVB 30 mJ/cm2,radiation 1 h +SSB 5 g/L).One hour before UVB irradiation,SSB water extracts were added into the culture medium.18 hours after UVB radiation,cells were collected.The morphology of cells were observed by trypan blue staining.The expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,p53,Bcl-2,Bax and Caspase-3 were detected.Results Compared with control group,in UVB radiation group,the number of HaCaT cells stained increased,HaCaT cells appeared swelled and floated,but the cell morphology could still be seen;compared with UVB radiation group,in UVB+SSB group,the number of HaCaT cells stained decreased,HaCaT cells appeared less swelled， and the morphology of cells were largely restored.UVB radiation group was higher (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax，Caspase-3 and lower (P<0.05) in Bcl-2 expression than control group;UVB+SSB group was lower (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the expression level of Bcl-2 than UVB radiation group.Conclusion SSB water extracts can reduce the expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,Bax,Caspase-3 and increase the expression level of Bcl-2 in HaCaT cells after UVB radiation.

Ultraviolet rays；Radiation；Tibetan saussurea；HaCaT cell；Interleukin-6；Tumor necrosis factors α

青海省科學計劃項目(2013-Z-003)

810001青海省西寧市，青海大學附屬醫(yī)院皮膚病與性病學(郭硯)；青海大學研究生院(孫娟，王麗雯)

郭硯，810001青海省西寧市，青海大學附屬醫(yī)院皮膚病與性病學；E-mail:qhguoyan@163.com

R 358.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.012

2015-03-26；

2015-07-02)