鄒 振 東，丁 海 燕，孫 玉 梅，曹 方

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

長鏈二元酸（long chain dicarboxylic acid，DCA）是指碳鏈上含有10 個以上碳原子的直鏈脂肪族二元酸（DCn），是一種重要的精細化工原料［1］。發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸彌補了化學合成法生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不高等不足，因而受到廣泛關(guān)注［2］。目前，工業(yè)上采用發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)DC11－16，其中主要是利用熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）代謝烷烴來生產(chǎn)［3－4］。

培養(yǎng)基組分對熱帶假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸有著重要影響，該菌發(fā)酵產(chǎn)二元酸所用無機鹽有氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉［5－7］。培養(yǎng)基中磷酸二氫鈉為0.1%～0.2%，磷酸氫二鉀為0.4%～0.6%有利于長鏈二元酸積累［8］。作者研究了無機鹽對菌體發(fā)酵產(chǎn)十二碳二元酸的影響，以期為進一步提高菌株產(chǎn)二元酸能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 種

熱帶假絲酵母126－1菌株，大連工業(yè)大學生物工程學院實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁的制備：取一定量大麥，粉碎。取4倍于麥芽量的60 ℃水，在55～60 ℃下保溫糖化，不斷攪拌，并定時用碘液測定，直至加碘液無藍色反應(yīng)（約4～6h）。將糖化液用紗布過濾，除去殘渣，煮沸后再重復(fù)用脫脂棉過濾一次，即得澄清的麥芽汁。

固體斜面培養(yǎng)基：將澄清的麥芽汁加水稀釋至5°Bé，并加入2%瓊脂，于0.1MPa滅菌20min。

液體種子培養(yǎng)基：玉米漿3g／L，蔗糖5g／L，尿素3g／L，磷酸二氫鉀8g／L，正十二烷85.5g／L，酵母膏5 g／L，用自來水溶解，自然pH，于0.1 MPa滅菌20 min。其中尿素、正十二烷在0.05 MPa滅菌20min，接種時加入。

發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸氫二鈉6g／L，蔗糖5g／L，玉米漿1g／L，氯化鈉1g／L，磷酸二氫鉀2g／L，酵母膏5g／L，尿素2g／L，正十二烷171.0g／L，硫酸鎂1.5g／L，自來水溶解，自然pH，于0.1MPa滅菌20 min。其中尿素、正十二烷在0.05 MPa滅菌20min，接種時加入。

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化：將低溫冷藏的菌種取1環(huán)劃接到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)2d。

液體種子培養(yǎng)：在250 mL 三角瓶中裝入25mL種子培養(yǎng)基，接入2環(huán)經(jīng)斜面活化的菌體，于30 ℃、210r／min振蕩培養(yǎng)2d。

液體搖瓶發(fā)酵：在250 mL 三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基20mL和十二烷5mL，按6%的接種量接種，調(diào)pH 為7.5～8.0，于30 ℃、210r／min振蕩培養(yǎng)6d，每天用2.5mol／L氫氧化鈉調(diào)pH 為7.5～8.0。

1.4 十二碳二元酸的提取與測定

將發(fā)酵液離心棄沉淀，用濾紙過濾上清液。量取3mL過濾液置于碘量瓶中，加適量玻璃珠，在沸水浴中加熱，用6mol／L鹽酸調(diào)pH 至2.0～3.0，加入100 mL 乙醚，振蕩碘量瓶至十二碳二元酸完全溶解于乙醚中，靜置30 min 后取出50mL乙醚提取液置于100 mL 燒杯內(nèi)，在通風櫥中使乙醚揮發(fā)，得到析出物。用25mL 95%中性乙醇溶解析出物。加入2滴酚酞，用標準氫氧化鈉溶液滴定，記錄消耗的氫氧化鈉體積，計算十二碳二元酸的產(chǎn)量［9］。

ρ＝McV1／V2

式中：M為十二碳二元酸摩爾質(zhì)量，230g／mol；c為標準氫氧化鈉濃度，mol／L；V1為消耗氫氧化鈉體積，mL；V2為發(fā)酵液體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸鹽對菌體產(chǎn)酸的影響

磷酸鹽除對細胞壁合成有重要作用外，還對培養(yǎng)液起到緩沖作用，磷酸根離子與H＋結(jié)合更有利于細胞內(nèi)二元酸溢出，減少胞內(nèi)積累抑制，這有利于菌體產(chǎn)酸。為了確定磷酸鹽的最適添加量，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加0～7g／L 的磷酸氫二鈉和0～2.5g／L 的磷酸二氫鉀，搖瓶發(fā)酵6d后測定菌體產(chǎn)酸量，測定結(jié)果如圖1、2所示。

由圖1、2可知，菌體產(chǎn)酸量受磷酸鹽量的影響較顯著，隨著磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀添加量的上升，菌體產(chǎn)酸量增大，在其質(zhì)量濃度分別為5.0和1.0g／L時，菌體產(chǎn)酸量均達到最高，分別為45.72和34.29g／L。

圖1 磷酸氫二鈉質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of Na2HPO4concentration on DC12yield

圖2 磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of KH2PO4concentration on DC12yield

2.2 磷酸與磷酸鹽對菌體產(chǎn)酸的影響

磷酸鹽中的金屬離子可能影響菌體產(chǎn)酸過程中相關(guān)酶的酶活性。為了考察磷酸鹽帶入金屬離子對菌體產(chǎn)酸的影響，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在相同磷含量下，添加磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度分別為5.0和1.0g／L，每天測定菌體產(chǎn)酸量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 磷酸與磷酸鹽對產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of phosphoric acid and phosphate on DC12yield

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，添加磷酸鹽和磷酸的實驗組中菌體產(chǎn)酸量都呈現(xiàn)上升趨勢，但添加磷酸的實驗組增長幅度更大，可能是由于磷酸促進了菌體生長，從而有利于菌體產(chǎn)酸。發(fā)酵5d后，添加磷酸的培養(yǎng)基中菌體產(chǎn)酸量達到最高，為58.12g／L。在發(fā)酵6d時產(chǎn)酸量出現(xiàn)下降，可能是由于發(fā)酵后期由于碳源不足，使生成的二元酸被菌體消耗利用或者分解。因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸不但使二元酸產(chǎn)量有所提高，而且相比添加磷酸鹽促進菌體產(chǎn)酸而言，縮短二元酸生產(chǎn)時間，提高了經(jīng)濟效益。

2.3 氯化鈉對菌體產(chǎn)酸的影響

鈉離子在細胞中主要起維持滲透壓的作用，這有利于細胞中物質(zhì)運輸。為了確定氯化鈉的適宜添加量，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0～2.5g／L的氯化鈉，搖瓶發(fā)酵6d后，菌體產(chǎn)酸測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 氯化鈉質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on DC12yield

由圖4可知，隨著氯化鈉質(zhì)量濃度的增加，菌體產(chǎn)酸量呈現(xiàn)下降趨勢?？赡苁怯捎诎l(fā)酵培養(yǎng)基中添加的Na2HPO4已經(jīng)提供了適宜的Na＋，再添加氯化鈉使得細胞外滲透壓升高，不利于細胞正常新陳代謝，從而影響了菌體產(chǎn)酸，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要再添加氯化鈉。

2.4 硫酸鎂對菌體產(chǎn)酸的影響

鎂離子是許多重要酶的激活劑，影響基質(zhì)的氧化和蛋白質(zhì)的合成。硫是構(gòu)成細胞蛋白質(zhì)的主要成分，也是構(gòu)成一些酶的活性基［10］。為了確定硫酸鎂的最適添加量，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0～2.5g／L的硫酸鎂，搖瓶發(fā)酵6d后，菌體產(chǎn)酸測定結(jié)果如圖5 所示。由圖5可知，菌體產(chǎn)酸量受硫酸鎂的影響較顯著，隨著硫酸鎂質(zhì)量濃度的增加，菌體產(chǎn)酸量逐漸下降。這可能是由于鎂離子促進了脂肪酸β－氧化中的活化過程，使得二元酸被消耗［11］，因此發(fā)酵培養(yǎng)基中不應(yīng)添加硫酸鎂。

圖5 硫酸鎂質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of MgSO4concentration on DC12yield

3 結(jié) 論

無機鹽對熱帶假絲酵母菌體發(fā)酵產(chǎn)十二碳二元酸有著重要影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5.0g／L磷酸氫二鈉和1.0g／L 磷酸二氫鉀時，菌體產(chǎn)酸量最高分別可達45.72和34.29g／L。添加硫酸鎂和氯化鈉均不利于菌體產(chǎn)酸，添加磷酸有利于菌體產(chǎn)酸，并能縮短發(fā)酵周期。

［1］桂秋芬，姚嘉晏，蔣洋松，等.利用熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸的研究進展［J］.化學與生物工程，2014，31（1）：17－22.

［2］陳遠童.長鏈二元酸及其二步開發(fā)有待解決的問題［J］.微生物學通報，2002，29（1）：104.

［3］陳遠童，郝秀珍，龐月川.十五碳二元酸的發(fā)酵研究［J］.微生物學報，1995，35（6）：433－437.

［4］陳遠童.十二碳二元酸工業(yè)生產(chǎn)實驗研究［J］.微生物學通報，1998，25（4）：244.

［5］王麗菊.發(fā)酵法生產(chǎn)十五碳二元酸［D］.無錫：江南大學，2008：27－29.

［6］羅榮.十二碳二元酸（DC12）生產(chǎn)菌株的選育與培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究［D］.天津：南開大學，2002：32－37.

［7］周海燕.十三碳二元酸的菌種及發(fā)酵初步研究［D］.南京：南京工業(yè)大學，2008：32－37.

［8］沈永強，樓純菌，徐可仁，等.石油發(fā)酵長鏈二元酸的研究（Ⅲ）［J］.植物生理與分子生物學學報，1979，5（4）：385－393.

［9］陳遠童.長鏈二元酸發(fā)酵的特點及其控制［J］.微生物通報，2001，28（4）：102.

［10］任剛，陳遠童.十二碳二元酸的發(fā)酵研究［J］.生物工程學報，2000，16（2）：198－202.

［11］王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學：下冊［M］.北京：高等教育出版社，2002：232－234.