李一錦，夏善紅

(1.中國(guó)科學(xué)院 電子學(xué)研究所 傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

0 引 言

近年來，隨著工業(yè)廢水、生活污水等的大量排放，水污染情況日益嚴(yán)重。我國(guó)制定了GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，將水質(zhì)分為5 類。水質(zhì)分類指標(biāo)主要包括化學(xué)需氧量(COD)、五日生化需氧量(BOD5)、氨氮、總磷、總氮等。其中，生化需氧量(BOD)是指在規(guī)定條件下，微生物分解水中某些可氧化物質(zhì)，特別是有機(jī)物所進(jìn)行的生物化學(xué)過程中所消耗的溶解氧的量［1］。BOD 是表征水中有機(jī)物含量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其值越大，水中有機(jī)污染物含量越多，污染越嚴(yán)重。我國(guó)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為BOD5，即水樣充滿完全密閉的溶解氧瓶中，在(20±1)℃的暗處培養(yǎng)5 d±4 h 或(2+5)d±4 h，分別測(cè)定培養(yǎng)前后水樣中溶解氧的量，由2 次測(cè)量的差值計(jì)算每升樣品消耗的溶解氧。該方法存在測(cè)定精度低、重現(xiàn)性差、耗時(shí)長(zhǎng)及操作繁瑣等缺點(diǎn)，不適于BOD 的快速在線監(jiān)測(cè)。測(cè)壓法［2］、檢壓庫(kù)侖法操作過程簡(jiǎn)便，但不能縮短培養(yǎng)周期;活性污泥曝氣法準(zhǔn)確度高，分析過程簡(jiǎn)便，但由于曝氣過程中培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空氣流量不易控制，不具有普遍適用性。

1977 年，Karube I 等人［3］首次提出將從土壤中分離出來的微生物固定在膠原蛋白膜上，并與氧電極組成微生物傳感器，檢測(cè)廢水BOD。該方法實(shí)現(xiàn)了BOD 的快速測(cè)定(1 h 以內(nèi))，簡(jiǎn)化了操作步驟，但其輸出信號(hào)僅能在10 d 內(nèi)保持穩(wěn)定。此后，很多科學(xué)工作者對(duì)BOD 快速測(cè)定進(jìn)行了研究［4～10］。

本文闡述了BOD 微生物傳感器制備中選取微生物、固定微生物和選取換能器等關(guān)鍵技術(shù)，分析了不同方法的特點(diǎn);分別對(duì)構(gòu)成BOD 檢測(cè)系統(tǒng)的各個(gè)部分進(jìn)行了總結(jié);討論了目前BOD 微生物傳感器研究中存在的問題，并對(duì)其研究發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 BOD 微生物傳感關(guān)鍵技術(shù)

BOD 微生物傳感器一般由兩部分組成:生物識(shí)別元件和轉(zhuǎn)換元件。生物識(shí)別元件是利用微生物的生化反應(yīng)對(duì)待測(cè)底物進(jìn)行識(shí)別響應(yīng)的部分，一般分為微生物的選取和培養(yǎng)以及微生物固定兩個(gè)步驟。轉(zhuǎn)換元件是將生物響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換成可測(cè)電信號(hào)、光信號(hào)等的部分。

1.1 微生物的選取和培養(yǎng)

BOD 微生物傳感器中，所選微生物需要具有廣譜性(即對(duì)待測(cè)底物的低選擇性)、穩(wěn)定性、無毒和對(duì)環(huán)境的耐受性等。一般作為生物識(shí)別元件的微生物可以是單一菌種、菌群、死細(xì)胞或酶等。

單一菌種作生物識(shí)別元件的微生物傳感器具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性好、信號(hào)重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但由于其代謝能力有限，一般只能檢測(cè)特定類型的廢水。常用于單一菌種檢測(cè)的微生物包括皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)［4］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［5］，大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)［6］，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［7，8］等。Arlyapov V 等人［9，10］發(fā)現(xiàn)C.maltosa，C.blankii，和D.hansenii 三種微生物均具有對(duì)水中有機(jī)物的氧化能力。其中，D.hansenii對(duì)實(shí)驗(yàn)中的34 種有機(jī)物均具有較好的降解能力，利用其制備的BOD 傳感器檢測(cè)范圍可達(dá)0.7 ～207 mg/L。

由菌群構(gòu)成的微生物傳感器一般廣譜性好，能實(shí)現(xiàn)多種有機(jī)物的快速降解，但由于多種微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)或捕食關(guān)系，傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。Kumlanghan A等人［11］利用從橡膠工業(yè)廢水中分離出的活性污泥作為生物識(shí)別元件制備BOD 微生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)橡膠工業(yè)廢水的在線和離線檢測(cè)，線性范圍5 ～60 mg/L，可穩(wěn)定測(cè)量15 d(每日測(cè)量3 次)，穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)偏差±8.3%。為了利用菌群的廣譜性，同時(shí)保持系統(tǒng)的穩(wěn)定性，研究人員利用流動(dòng)注射系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。Liu Jing 等人［11］選用菌群作為生物識(shí)別元件實(shí)現(xiàn)BOD 在線監(jiān)測(cè)，檢測(cè)線性范圍為5 ～700 mg/L。通過注射新的菌糊進(jìn)行微生物的更新而不用分解傳感器系統(tǒng)，微生物可日更新，更新后24 h 內(nèi)傳感器響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為±2.4%。

死細(xì)胞作為生物識(shí)別元件，可批量加工、長(zhǎng)期儲(chǔ)存，其酶系統(tǒng)受細(xì)胞壁的保護(hù)而免于失活或中毒，盡管已失去自修復(fù)和再生能力，其也能保持良好的活性和穩(wěn)定性。Tan T C 等人［13］應(yīng)用加熱到280 ℃并真空干燥2.5 min 得到的B.subtilis 死細(xì)胞制備的BOD 微生物傳感器，其線性范圍和重復(fù)性等均與固定活體微生物的結(jié)果類似。相比之下，雖然該傳感器的靈敏度較低，恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，但其穩(wěn)定性可維持140 d(含400 次測(cè)量)。Kim Mal Nam 等人［14］利用酶和微生物共同作為生物識(shí)別元件，固定Klebsiella sp.后，再固定相應(yīng)的多糖酶，從而提高傳感器對(duì)相應(yīng)多糖的響應(yīng)和BOD的檢測(cè)靈敏度。選定菌種后，還需選擇合適的生長(zhǎng)時(shí)期。一般的，微生物的生長(zhǎng)時(shí)期分為遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物量很大且具有較高的細(xì)胞活性，適宜作為生物識(shí)別元件。李洛娜等人［5］選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的枯草芽孢桿菌進(jìn)行固定，制成微生物膜，進(jìn)行BOD 檢測(cè)。該傳感器的響應(yīng)時(shí)間僅為8 min。

1.2 微生物固定化

微生物固定具有熱穩(wěn)性較高，可重復(fù)使用和反應(yīng)后無需與反應(yīng)物分離等優(yōu)點(diǎn)，且有研究發(fā)現(xiàn)，固定微生物制備的傳感器具有更寬的線性范圍［15］，故一般傳感器制備過程中需要固定微生物。固定材料和方法影響著傳感器的靈敏度、響應(yīng)時(shí)間和使用壽命等。目前，微生物固定方法主要有吸附法、包埋法、夾層法和交聯(lián)法等。

吸附法是利用載體之間的靜電相互作用進(jìn)行細(xì)胞固定，可分為物理吸附和離子吸附。吸附法操作簡(jiǎn)單，對(duì)微生物無毒害作用，細(xì)胞活性損失小，但長(zhǎng)時(shí)間使用后菌種易脫落，影響使用壽命。Dhall P 等人［16］運(yùn)用吸附法將增效的菌群固定在尼龍膜(孔徑為0.45 μm)上制成微生物膜，固定于氧電極上構(gòu)成BOD 傳感器。該傳感器響應(yīng)時(shí)間為90 min，可以在400 d 內(nèi)、間斷測(cè)量條件下保持穩(wěn)定性和活性。

包埋法是最常用的方法，它是將細(xì)胞裹于凝膠的微小格子內(nèi)或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)。包埋法制備的微生物膜機(jī)械強(qiáng)度雖有提高，微生物活性也較交聯(lián)法高，但該方法不適用于涉及大分子物質(zhì)的反應(yīng)，故在實(shí)際檢測(cè)中需對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理。Liu Ling 等人［17］利用共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)技術(shù)研究固定在有機(jī)無機(jī)復(fù)合材料上菌種的變形，進(jìn)而研究其長(zhǎng)期穩(wěn)定性機(jī)理。研究結(jié)果表明，T.cutaneum 2.570 細(xì)胞包埋于硅和PVA－g－P(4－VP)的混合物中，其儲(chǔ)存時(shí)以節(jié)分生孢子狀態(tài)存在，這些休眠狀態(tài)的細(xì)胞能抵抗環(huán)境壓力，并能在適當(dāng)?shù)臈l件下被激活。Wang Jianlong 等人［18］將活性污泥包埋于聚乙烯醇(PVA)中形成珠狀顆粒置于特制的籠子中，籠子連接到小型升降機(jī)上，制成反應(yīng)器式BOD 傳感器。該固定方法使得溶解氧和有機(jī)物的傳質(zhì)阻力明顯降低，有效提高了BOD 檢測(cè)的靈敏度，并能夠保持生物活性70 d(每天測(cè)量8 次)。

夾膜法制備的微生物膜，使用壽命延長(zhǎng)，菌體不易流失，操作簡(jiǎn)單，無需任何化學(xué)處理，重現(xiàn)性較好，尤其適用于微生物和組織膜的制作，但其所需活化時(shí)間較長(zhǎng)，制備中存在菌種定量問題。

交聯(lián)法是化學(xué)固定方法，采用非水溶性載體，如戊二醛、偶聯(lián)苯胺和牛血清白蛋白等。Yang Zhen 等人［4］將含有T.cutaneum 的混合溶液(含光致交聯(lián)的聚酰亞胺)澆鑄在氧電極陰極，然后在N2環(huán)境中紫外曝光3 min，制備好的BOD 傳感器置于磷酸緩沖液中。該法制備的微生物膜使用壽命提高，但固定微生物的成活率較低，制備過程較復(fù)雜，交聯(lián)劑用量和微生物量相互制約。

此外，微生物也可通過制備一定的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定。Liu Changyu 等人［19］用HF/NH4F 溶液沖洗螺旋玻璃管內(nèi)壁得到粗糙內(nèi)表面。在優(yōu)化的流速和溫度下向管內(nèi)通入活性污泥培養(yǎng)液，通過溶解氧探針測(cè)量注射校準(zhǔn)溶液后的電流響應(yīng)來檢驗(yàn)生物膜形成情況，當(dāng)電流下降到一個(gè)穩(wěn)定值時(shí)，穩(wěn)定的生物膜形成。

1.3 換能器

BOD 微生物傳感器根據(jù)其換能器的不同可大致分為電化學(xué)型和光學(xué)型。電化學(xué)型BOD 傳感器又可分為氧電極型、媒介體型和微生物燃料電池型等。

1.3.1 氧電極型

氧電極型BOD 微生物傳感器最為普遍，是在電極表面覆蓋氧滲透膜和微生物膜，通過測(cè)量添加樣品前后溶液中溶解氧濃度變化檢測(cè)BOD。研究人員在工作電極選擇、電極表面修飾以及氧滲透膜的制備等方面都進(jìn)行了廣泛的研究。

Ivandini T A 等人［20］研制了一種具有高穩(wěn)定性的修飾金納米顆粒的摻硼金剛石電極，用于測(cè)定水中溶解氧，進(jìn)而測(cè)定BOD。金納米顆粒催化O2的還原反應(yīng)，其與摻硼金剛石之間的共價(jià)鍵提高了表面修飾的穩(wěn)定性，從而提高了傳感器的穩(wěn)定性，其電流響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.9%。Pang Heileung 等人［21］將TMOS，DiMe－DMOS，0.1 mol/L HCl和去離子水以1∶2.15∶1.7∶1.1 的體積比混合制備硅溶膠。該硅溶膠在25 ℃水浴中攪拌3.5 h 后以7 500 rpm 離心4 min。收集離心管底部的凝膠部分(1 mL)并將其與［Ru(dpp)3］Cl2(250 μL)溶液混合。32 μL 混合液置于每個(gè)微滴定板孔內(nèi)，室溫暗處保存6 d 以制備一種高吞吐量的氧敏感膜。該膜中心厚度小于10 μm，均一無裂縫，具有很好的穩(wěn)定性，可與聚苯乙烯微滴定板緊密黏附，且由于其疏水性可防止溶于水的離子或化合物的干擾，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品中溶解氧的測(cè)定。

1.3.2 媒介體型

媒介體型BOD 微生物傳感器是以可逆氧化還原物，如鐵氰化鉀、二茂洛鐵等，替代溶解氧促進(jìn)有機(jī)物發(fā)生生化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移，通過測(cè)量電極表面媒介體發(fā)生氧化反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移數(shù)實(shí)現(xiàn)BOD 的檢測(cè)。該方法有兩個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn):媒介體具有極強(qiáng)的氧化還原性能，可提高反應(yīng)速率，減少反應(yīng)時(shí)間;媒介體具有很高的溶解性，使輸出信號(hào)較大，檢測(cè)范圍較寬，有效克服了由于O2在水中的低溶解度帶來的響應(yīng)信號(hào)弱和樣品需大量稀釋的問題。

Bonetto M C 等人［22］研究發(fā)現(xiàn)，選用K.pneumoniae 并利用鐵氰化物進(jìn)行BOD 快速檢測(cè)時(shí)，樣品中的溶解氧對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，故無需對(duì)樣品進(jìn)行除氧預(yù)處理，用GGA 溶液和OECD 溶液標(biāo)定時(shí)其線性范圍分別為30 ～500mg/L 和30 ～200mg/L。Oota S 等人［23］將鐵氰化物溶于磷酸載體溶液，制備流動(dòng)注射微生物反應(yīng)器式BOD 傳感器。由于每次僅注射少量樣品溶液，系統(tǒng)的操作穩(wěn)定性較高。媒介體不僅可以溶于載體溶液，也可以被固定成膜參與反應(yīng)。Liu Ling 等人［24］將E.coli 和中性紅(neutral red，NR)媒介體混合固定成膜置于玻碳電極上，由于中性紅的強(qiáng)電子傳輸特性和膜的滲透性，制備的傳感器較分別固定兩層膜具有更強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)。對(duì)于某些微生物，僅使用一種媒介體不能進(jìn)行測(cè)試，需要采用雙媒介體系統(tǒng)。Nakamura H 等人［8］研究發(fā)現(xiàn)，真核生物S.cerevisiae 只有在鐵氰化物和甲萘醌共同存在時(shí)才能進(jìn)行響應(yīng)。分析認(rèn)為甲萘醌可以滲入菌種外壁，產(chǎn)生甲萘醌基團(tuán)，與鐵氰化物共同作用實(shí)現(xiàn)電子傳遞。

1.3.3 微生物燃料電池型

微生物燃料電池型BOD 傳感器是以微生物為催化劑，將有機(jī)物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為電能的裝置［25］。電池轉(zhuǎn)化率一定，其產(chǎn)生的電荷量與底物質(zhì)量濃度呈正比。典型微生物燃料電池由陽極室和陰極室構(gòu)成，2 個(gè)極室由質(zhì)子交換膜隔開，陽極室保持厭氧環(huán)境而陰極室保持好氧環(huán)境，陰陽兩極通過外電路連接。陽極室中，微生物催化分解有機(jī)物并釋放電子和質(zhì)子，電子傳遞至陽極，后經(jīng)外電路傳遞至陰極，質(zhì)子經(jīng)質(zhì)子交換膜傳遞至陰極，并與來自外電路的電子和陽極室的O2反應(yīng)生成水。微生物燃料電池型BOD 傳感器響應(yīng)時(shí)間短，適用范圍廣，穩(wěn)定性好且操作簡(jiǎn)單，但質(zhì)子交換膜的成本較高。吳鋒等人［26］研制了一種單室微生物燃料電池型BOD 傳感器。以MnO2代替金屬鉑作陰極催化劑，以陽離子交換膜代替昂貴的質(zhì)子交換膜，對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行檢測(cè)。傳感器線性范圍為5 ～50 mg/L，與BOD5的相對(duì)誤差在4.0%以內(nèi)。

1.3.4 光學(xué)型

光學(xué)型BOD 傳感器是利用光源發(fā)出的光經(jīng)過不同濃度樣品時(shí)，會(huì)引起光強(qiáng)、頻率、相位、偏振態(tài)等光學(xué)參數(shù)的變化，通過檢測(cè)這些參數(shù)的變化獲得待測(cè)樣品信息。光學(xué)型BOD 傳感器具有實(shí)時(shí)、快速、響應(yīng)不受樣品流速影響等特點(diǎn)，但傳感器靈敏度、穩(wěn)定性和使用壽命等方面還不能滿足現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的需求。

Sakaguchi T 等人［6］將從Vibrio fischeri 中提取的發(fā)光基因(lux A－E)植入E.coli，制成BOD 熒光傳感器。樣品中有機(jī)物含量不同時(shí)，微生物的發(fā)光強(qiáng)度不同，其檢測(cè)范圍為(3～200)×10－6。除利用微生物自身發(fā)光，也可通過加入發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。Nakamura H 等人［7］利用S.cerevisiae與甲萘醌和溶解的有機(jī)物之間的還原反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫和過氧根離子，這些產(chǎn)物在鐵氰化物的催化作用下與發(fā)光氨反應(yīng)并產(chǎn)生430 nm 的化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度隨有機(jī)物濃度的增加而增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)上證明了該方法用于BOD 檢測(cè)的可行性。Nakamura H 等人也實(shí)驗(yàn)了一種通過測(cè)定吸光值檢測(cè)BOD 的方法［27］，即選擇2，6－二氯酚吲哚酚鈉(DCIP)作為還原顏色指示劑，微生物降解有機(jī)物，通過檢測(cè)DCIP 吸光值的減少量即可得到BOD 值。Zheng Ruijuan 等人［28］用CdS 修飾碳電極，加陰極脈沖電壓使電極表面發(fā)生熱電子引發(fā)的陰極電化學(xué)發(fā)光，光強(qiáng)隨樣品中溶解氧濃度的增大而增強(qiáng)，檢測(cè)線性范圍為1.7 ～33 mg/L，9 次平行檢測(cè)(8 mg/L溶解氧)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%。該方法用于BOD 中溶解氧檢測(cè)，價(jià)格便宜，易于制造，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

1.3.5 其它類型傳感器

Zhang Jinzhong 等人［29］研制了一種通過測(cè)定壓電系統(tǒng)頻率改變量檢測(cè)BOD 的傳感器。微生物將有機(jī)物分解為無機(jī)或有機(jī)小分子，使樣品電導(dǎo)率發(fā)生變化，電極輸出連接晶振，測(cè)晶振的頻率改變量以測(cè)定BOD。該方法無需固定細(xì)菌，操作簡(jiǎn)單方便。

2 BOD 微生物傳感系統(tǒng)

BOD 微生物傳感系統(tǒng)需要完成從采樣到得到準(zhǔn)確BOD 結(jié)果的全過程。除研究構(gòu)成傳感器的關(guān)鍵技術(shù)外，也需要進(jìn)行預(yù)處理水樣，選取標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化測(cè)試條件和選擇測(cè)定方法等環(huán)節(jié)。

2.1 水樣預(yù)處理

采集到的水樣一般不能直接進(jìn)行檢測(cè)，若樣品BOD 超出檢測(cè)范圍，需進(jìn)行稀釋。Dhall P 等人［16］利用軟件快速計(jì)算樣品稀釋倍數(shù)，構(gòu)建的BOD 檢測(cè)系統(tǒng)可以用于高BOD的飲料工業(yè)廢水的檢測(cè)，若樣品中含有大量重金屬離子，會(huì)影響微生物活性。Qian Zhengrong 等人［16］研究發(fā)現(xiàn)通過加入有機(jī)螯合劑EDTA 或DDTC 等可使重金屬離子形成金屬絡(luò)合物，從而減輕重金屬離子對(duì)檢測(cè)的影響。由于BOD 微生物傳感器的反應(yīng)時(shí)間較短，若樣品中含有難生物降解的有機(jī)物將嚴(yán)重影響檢測(cè)，可以先將難以快速生物降解的有機(jī)物催化分解，再進(jìn)行微生物降解。Chee Gab Joo 等人［30］利用臭氧分解產(chǎn)生的自由基分解樣品中難以生物降解的有機(jī)物，然后用BOD 傳感器進(jìn)行檢測(cè)。臭氧預(yù)處理后1 mg/L BOD 溶液的響應(yīng)強(qiáng)度可達(dá)處理前的1.6 倍，傳感器檢測(cè)下限為0.5 mg/L，響應(yīng)時(shí)間縮短至5 min，標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯減小。該研究組還探索了一種光催化預(yù)處理方法［32］。利用TiO2作光催化劑，僅曝光4 min 即可對(duì)樣品進(jìn)行降解預(yù)處理。此外，利用電化學(xué)氧化過程［33］、超聲和加熱處理［34］等人也可對(duì)有機(jī)物進(jìn)行降解預(yù)處理。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的選取

對(duì)BOD 傳感器進(jìn)行標(biāo)定時(shí)，國(guó)標(biāo)采用的標(biāo)準(zhǔn)溶液是GGA 溶液，即150 mg/L 谷氨酸和150 mg/L 葡萄糖溶液的混合液，其BOD 值為(198±31)mg/L。很多BOD 傳感器的標(biāo)定以GGA 溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液［3，4，16，17］。但是GGA 溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液存在一些缺陷:GGA 溶液僅含2 種有機(jī)物，葡萄糖是大多數(shù)微生物的碳源，而谷氨酸一般需要較長(zhǎng)時(shí)間才能被分解。因此，一些BOD 微生物傳感器選擇OECD溶液(organization for economic cooperation and development solution)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)定［35］。此外，AWW(artificial wastewater)也可用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。Liu Changyu 等人［19］利用AWW 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，自來水作為空白溶液進(jìn)行標(biāo)定，避免了磷酸緩沖液引入的二次污染，可實(shí)現(xiàn)太湖水樣BOD 的快速檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的選取與檢測(cè)方法和廢水的類型有關(guān)，選取適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液可以提高傳感器檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

2.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

測(cè)定過程中，微生物受環(huán)境影響很大。pH 可以改變細(xì)胞膜的帶電荷狀態(tài)，影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝過程中酶的活性。溫度影響微生物中酶和蛋白質(zhì)的合成和活性。不同微生物生長(zhǎng)代謝所需pH 和溫度不同，所以，需要針對(duì)所選微生物進(jìn)行調(diào)節(jié)［6，9］。此外，測(cè)試過程中的緩沖溶液濃度、微生物培養(yǎng)時(shí)間、傳感器響應(yīng)時(shí)間以及流動(dòng)注射系統(tǒng)中溶液流速等都需要進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 測(cè)定方法的選擇

BOD 檢測(cè)方法可分為穩(wěn)態(tài)法和起始速率法。穩(wěn)態(tài)法是測(cè)定樣品反應(yīng)前后輸出的2 個(gè)穩(wěn)定值，求差值ΔI 進(jìn)行計(jì)算，輸出信號(hào)與微生物的數(shù)量、生存能力和呼吸速率有關(guān)。該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，檢測(cè)下限低，但檢測(cè)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間都較長(zhǎng)。起始速率法是檢測(cè)加入樣品后輸出信號(hào)的變化率(dI/dt)，輸出信號(hào)受有機(jī)物和氧氣的傳質(zhì)速率影響。該方法檢測(cè)靈敏度高，線性范圍寬，響應(yīng)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間均較短，但易受整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)不穩(wěn)定因素的影響，穩(wěn)定性不如穩(wěn)態(tài)法［36］。

2.5 提高信號(hào)強(qiáng)度

一般的，BOD 傳感器固定的微生物量有限，水中O2溶解度較低，導(dǎo)致輸出信號(hào)微弱不易檢測(cè)。如1.3.3 中提到的，可以使用媒介體參與反應(yīng)，以消除因水中O2溶解度小引起的信號(hào)強(qiáng)度限制。從菌種角度出發(fā)，可選用廣譜性好的菌種。從樣品角度出發(fā)，可進(jìn)行預(yù)處理將難降解有機(jī)物分解，便于微生物的代謝。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，菌種處于“饑餓”狀態(tài)會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的外源代謝能力。Yoshida N 等人［35］選擇在使用前處于有氧、無營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶液(0.1 mol/L NaCl 溶液)中培養(yǎng)的微生物制備傳感器，輸出信號(hào)提高約7 倍，避免了使用前復(fù)雜的預(yù)處理過程。

3 有待研究和解決的問題

1)由于BOD5和BOD 微生物傳感器的檢測(cè)機(jī)理不完全一致，BOD5可以檢測(cè)到難降解和易降解的有機(jī)物，而BOD 微生物傳感器由于檢測(cè)時(shí)間短只能檢測(cè)易降解有機(jī)物。盡管2 個(gè)變量線性相關(guān)顯著，但它們之間的內(nèi)在聯(lián)系還有待充分的研究和驗(yàn)證，需要對(duì)檢測(cè)機(jī)理做進(jìn)一步深入的研究。

2)傳感器通用性有待提高。不同水體的BOD 含量相差甚遠(yuǎn)，主要有機(jī)污染物不同，干擾物質(zhì)也不同。因此，目前針對(duì)不同類型的廢水設(shè)計(jì)出了特定的BOD 傳感器［16，23］。研究人員正在探索通用型BOD 傳感器。Raud Merlin 等人［37］將固定有不同微生物的BOD 傳感器組成陣列，利用所選微生物對(duì)特定物質(zhì)的降解性，運(yùn)用PLS(partial least squares)回歸方法處理數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)含有不同難降解有機(jī)物OECD 廢水的BOD 測(cè)定。若要使BOD 檢測(cè)走向規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，研究人員仍需進(jìn)一步探索歸一化、通用化的檢測(cè)原理和方案。

3)傳感器檢測(cè)穩(wěn)定性和一致性有待提高。目前，BOD微生物傳感器雖有部分進(jìn)行了商業(yè)化，但大部分仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。微生物的穩(wěn)定性、微生物固定的一致性和微生物膜活性減弱導(dǎo)致的更換等都將影響B(tài)OD 微生物傳感器的性能，故其要投入應(yīng)用，還需提高其穩(wěn)定性和一致性。

4)微生物傳感器的微型化、集成化程度不夠，難以進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。目前商業(yè)化的BOD 微生物傳感器的體積和質(zhì)量均偏大，不能完全達(dá)到便攜式的要求。Yang Zhen等人通過引入對(duì)照組電極(不固定微生物)，僅測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組電極參數(shù)之間的差值即可實(shí)現(xiàn)BOD 測(cè)定，省去了攪拌子和充氣泵等設(shè)備。研究人員也在探索將微電極、微加工技術(shù)等應(yīng)用于微生物傳感器以實(shí)現(xiàn)整個(gè)傳感器系統(tǒng)的微型化和便攜化。

4 結(jié)束語

BOD 檢測(cè)對(duì)于水質(zhì)和一些生化過程的監(jiān)測(cè)具有重要意義。由于傳統(tǒng)BOD5存在耗時(shí)長(zhǎng)，重現(xiàn)性差，易受干擾等問題，BOD 的快速測(cè)定成為發(fā)展方向。今后須結(jié)合生物技術(shù)與信號(hào)處理技術(shù)，在保證生物活性的基礎(chǔ)上，提高固定的穩(wěn)定性與一致性，實(shí)現(xiàn)對(duì)各類廢水的統(tǒng)一檢測(cè)。另外，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合微生物檢測(cè)與微加工技術(shù)，促進(jìn)傳感器的微型化與集成化。

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