張 洋綜述，張小明，劉 剛審校

（1.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院放射科 644000；2.醫(yī)學(xué)影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川南充637000）

噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)特殊的基因重組表達(dá)技術(shù)，亦是一種強(qiáng)大的篩選工具。1985年，Smith等成功地創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù)；1990年，Scott等在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展并構(gòu)建了噬菌體展示隨機(jī)肽庫。噬菌體肽庫技術(shù)是一種新興的藥物發(fā)現(xiàn)工具［1］，通過噬菌體隨機(jī)肽庫篩選獲得的肽可以作為分子載體運(yùn)載藥物，起到生物導(dǎo)彈的功能。篩選的肽也可以直接與藥物靶點(diǎn)分子特異性結(jié)合，起到生物治療的作用。近年來，噬菌體肽庫技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，如癌癥的檢測和診斷、腫瘤相關(guān)抗原的篩選、腫瘤藥物的研制、腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤的基因治療研究等。現(xiàn)就近年來噬菌體展示肽庫技術(shù)在篩選腫瘤靶向短肽研究中的應(yīng)用綜述如下。

1 噬菌體展示肽庫

目前，常用于噬菌體展示的噬菌體有2 種類型：（1）M13線性噬菌體；（2）T7噬菌體。噬菌體展示肽庫是把隨機(jī)短肽片段與噬菌體的P3或P8基因的N 端進(jìn)行融合，通過展示技術(shù)讓隨機(jī)短肽得以獨(dú)立表達(dá)并具有生物學(xué)功能。噬菌體肽庫構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是得到足夠多的能獨(dú)立表達(dá)多肽的單克隆噬菌體，以便于靶標(biāo)的結(jié)合與識(shí)別。篩選的結(jié)果受多個(gè)因素的影響，而合理地應(yīng)用篩選方法是能得到高特異性、高親和力多肽的最重要的環(huán)節(jié)。

2 噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選腫瘤靶向短肽的研究

由于傳統(tǒng)的化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇精度較差，易產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，因此，腫瘤的藥物靶向治療尤為重要。利用能與腫瘤組織特異性結(jié)合的分子作為載體，將藥物導(dǎo)向腫瘤組織，這種方法可以顯著提高藥物導(dǎo)向的準(zhǔn)確度。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性，利用單克隆抗體為載體的藥物導(dǎo)向治療已成功地應(yīng)用于腫瘤。但這種療法的效果并不理想，主要的原因是由于抗體相對(duì)分子質(zhì)量較大，使其應(yīng)用效果降低。研究表明，噬菌體肽庫篩選系統(tǒng)提供的載體由于其具有相對(duì)分子質(zhì)量較小、穩(wěn)定性好、活性高等優(yōu)點(diǎn)，能較大程度上彌補(bǔ)單克隆抗體療法的不足［2］，因而廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷與治療的研究中。噬菌體隨機(jī)展示肽庫篩選技術(shù)在腫瘤導(dǎo)向治療研究中的應(yīng)用主要有4個(gè)方面：（1）篩選腫瘤親和短肽，與標(biāo)識(shí)劑結(jié)合后用于腫瘤療效的評(píng)價(jià)，為下一步診療計(jì)劃提供幫助；（2）篩選的腫瘤特異肽與各種化療藥物耦聯(lián)，進(jìn)而用于腫瘤的藥物導(dǎo)向治療研究；（3）獲得與腫瘤特異性結(jié)合的氨基酸序列后與基因片段進(jìn)行耦聯(lián)，用于腫瘤的基因治療的研究；（4）篩選腫瘤相關(guān)黏附分子的特異性結(jié)合短肽，用于抑制腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的研究。腫瘤導(dǎo)向治療最為重要的步驟是特異性載體的構(gòu)建與選擇。目前，在篩選肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤靶向短肽的研究中，已取得一定的成果。

2.1 肺癌靶向短肽的篩選 目前，肺癌靶向短肽的篩選靶標(biāo)主要為肺癌細(xì)胞和肺癌高表達(dá)的蛋白。He等［3］利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選出了能與肺癌H460細(xì)胞株特異性結(jié)合的環(huán)七肽（CSNIDARAC），實(shí)驗(yàn)證明此肽能在肺部腫瘤組織中集聚而在正常組織中量少，故有望用于肺癌的顯像與治療；潘雪刁等［4］從隨機(jī)噬菌體肽庫中篩選到了能與人肺癌NCI-H1299細(xì)胞高親和力結(jié)合的多肽ZS-5，但此肽在活體中的功能有待進(jìn)一步鑒定。此外，馮文彬等［5］利用噬菌體肽庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)了17個(gè)與肺癌相關(guān)的腫瘤基因，為肺癌的早期診斷提供了一定的依據(jù)。利用噬菌體肽庫技術(shù)能篩選出阻斷腫瘤發(fā)生的信號(hào)通路的短肽。據(jù)報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后與神經(jīng)菌毛素1（NRP1）有關(guān)。據(jù)此，Hong等［6］從噬菌體肽庫中篩選的多肽DG1和DG2能阻抑NRP1的表達(dá)，進(jìn)而有望改善非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后。

2.2 胃癌靶向短肽的篩選 腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者最主要的死因之一，阻斷胃癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移將極大地提高患者生存率。Bai等［7］篩選的多肽SMSIASPYIALE能夠特異性地靶向胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的組織，并且可以明顯抑制荷瘤鼠體內(nèi)胃癌GC9811-P細(xì)胞的黏附、浸潤及腹膜轉(zhuǎn)移。Zhang等［8］用噬菌體隨機(jī)十二肽庫對(duì)健康者胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1 和胃腺癌細(xì)胞株BGC823進(jìn)行減性輪選，獲得了與胃癌特異性結(jié)合的多肽AADNAKTKSFPV（AAD），它能區(qū)分胃癌與正常的胃黏膜，并且有作為胃癌早期診斷探針的潛力。此外，多耐藥性仍然是臨床藥物治療胃癌的重要挑戰(zhàn)。據(jù)此，Kang等［9］篩選出了能與胃癌多耐藥性細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽GMBP1（ETAPLSTMLSPY），通過體外和體內(nèi)藥物敏感性測定法、流式細(xì)胞儀分析和蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)表明多肽GMBP1辨認(rèn)出了一種新型葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）受體介導(dǎo)的多耐藥性表型，進(jìn)而對(duì)于胃癌細(xì)胞多耐藥性的研究及了解胃癌細(xì)胞的相關(guān)活動(dòng)提供了新的路徑。

2.3 肝癌靶向短肽的篩選 Zhang等［10］從噬菌體隨機(jī)7 肽庫中獲得了特異性的短肽序列FQHPSFI，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明人工固相法合成的多肽FQHPSFI能與肝癌細(xì)胞高親和力結(jié)合。王昆侖等［11］采用肝癌患者血清與噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行輪選，經(jīng)過3輪的吸附-洗脫-擴(kuò)增的淘篩過程后，得到的3個(gè)特異性的噬菌體克隆有望為肝癌的特異性診斷試劑提供載體，而Zhang等［12］用30例早期原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者血清進(jìn)行篩選并得到多肽HC1（RGWCRPLPKGEG），實(shí)驗(yàn)表明此模擬肽對(duì)早期原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌具有高的診斷效度，有望成為早期原發(fā)性肝癌的血清生物標(biāo)志物。在肝癌靶向短肽的篩選中，研究者不僅進(jìn)行了噬菌體隨機(jī)肽庫的體外篩選，還創(chuàng)新性地進(jìn)行了活體動(dòng)物的體內(nèi)篩選。Du等［13］將噬菌體隨機(jī)12文庫注入人源肝癌BEL7402細(xì)胞株的荷瘤裸鼠模型體內(nèi)進(jìn)行篩選，最終獲得了與肝癌組織高親和力結(jié)合的短肽。但有學(xué)者認(rèn)為，體內(nèi)篩選辦法更適合淘選與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的肽段［14］。

2.4 結(jié)腸癌靶向短肽的篩選 腫瘤抗原作為腫瘤的標(biāo)志物已逐漸受到人們的廣泛重視。研究表明腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG-72）高表達(dá)于許多類型的腫瘤中。據(jù)此，Rusckowski等［15］利用噬菌體隨機(jī)展示肽庫技術(shù)淘選出了能與TAG-72高親 和 力 結(jié) 合 的 2 肽 段 NLIWCRKEFARCTSDM 和NPGTCKD-KWIECLLNG，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，它們能特異性地結(jié)合到荷瘤鼠的TAG-72陽性表達(dá)的結(jié)腸癌瘤塊中。因此，這2條肽段有希望用于結(jié)腸癌的影像診斷，是否適用于其他TAG-72陽性表達(dá)腫瘤的影像診斷有待進(jìn)一步探究。細(xì)胞黏合素C 高表達(dá)于結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤等大多數(shù)實(shí)體腫瘤中。Kim 等［16］從噬菌體肽庫中篩選出與細(xì)胞黏合素C 特異性結(jié)合的短肽能減少細(xì)胞黏合素C 介導(dǎo)的細(xì)胞增殖與遷移。Hsiung等［17］以結(jié)腸腺癌細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行淘選并得到能與之結(jié)合的特異性七肽（VRPMPLQ）。此肽經(jīng)熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，它可以與結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合，且不能與正常組織細(xì)胞結(jié)合，故此肽段有助于結(jié)腸癌的早期診斷。

2.5 前列腺癌靶向短肽的篩選 前列腺癌細(xì)胞的特異性抗原為前列腺癌靶向短肽的篩選提供了路徑。Shen等［18］利用噬菌體肽庫技術(shù)，以固化的前列腺特異性膜抗原蛋白為靶分子，從隨機(jī)十五肽庫中篩選到高親和力的多肽SHSFSVGSGDHSPFT 和GRFLTGGTGRLLRIS，經(jīng)細(xì)胞熒光顯微鏡觀察這些多肽能靶向人前列腺癌的特異性膜抗原，獲得的多肽有望用于前列腺腫瘤的顯像與治療。成纖維細(xì)胞生長因子8b（FGF8b）是表達(dá)在前列腺癌的成纖維細(xì)胞生長因子8的主要同型，它與疾病的分期及評(píng)分有關(guān)。Wang等［19］從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選出與FGF8b特異性結(jié)合的多肽P12（HSQAAVP），實(shí)驗(yàn)表明此肽是FGF8b的拮抗劑，故有治療前列腺癌的潛力。Fagbohun等［20］以轉(zhuǎn)移性的前列腺癌PC-3M 細(xì)胞株為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，最終從噬菌體隨機(jī)肽庫中獲得了高親和力的噬菌體顆粒EPTHSWAT（展示在噬菌體表面的特定序列）。此特異性的噬菌體顆粒被修飾后能選擇性地作用于PC-3M 細(xì)胞并且能表達(dá)綠色熒光蛋白基因，故這種類噬菌體顆粒有望用于前列腺癌的治療基因的靶向傳遞，為靶向藥物的設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.6 其他腫瘤靶向短肽的篩選 據(jù)報(bào)道，酪氨酸蛋白激酶（c-Met）的異常表達(dá)與大多數(shù)種類的腫瘤有關(guān)。Zhao等［21］利用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)淘選到與c-Met高親和力結(jié)合的序列為YLFSVHWPPLKA 的多肽Met-pep1，實(shí)驗(yàn)表明此肽具有抑制人平滑肌肉瘤細(xì)胞生長增殖的功能。Sun 等［22］篩選的多肽EDIKPKTSLAFR 經(jīng)示蹤劑跟蹤實(shí)驗(yàn)后表明此多肽復(fù)合物能靶向鼻咽癌組織，故有望用于鼻咽癌的診斷。此外，喉癌、宮頸癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等靶向短肽的篩選均有文獻(xiàn)報(bào)道。也有研究者直接以腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物為靶標(biāo)進(jìn)行淘選［23］，總之，噬菌體肽庫技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于腫瘤靶向肽的篩選。

2.7 腫瘤血管靶向肽的篩選 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞與其他器官或組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞所處的微環(huán)境有差異，這種差異為噬菌體隨機(jī)多肽在體內(nèi)的特異性選擇提供了條件。此外，針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)而正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)的受體，亦有望找到腫瘤導(dǎo)向治療的靶點(diǎn)。Kelly等［24］以血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）蛋白為靶分子，利用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選出能與VCAM-1特異性結(jié)合的多肽（VHSPNKK）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此肽與納米顆粒耦聯(lián)的復(fù)合物能與表達(dá)VCAM-1的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞高親和力結(jié)合；而無此多肽序列的復(fù)合物則對(duì)腫瘤血管細(xì)胞沒有親和力。Qin等［25］根據(jù)人血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR-3）高表達(dá)于大多數(shù)腫瘤，從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選到能與表達(dá)VEGFR-3 的腫瘤特異性結(jié)合的短肽CSDSWAYWC，此肽有望成為腫瘤導(dǎo)向治療的載體。此外，Zanuy等［26］篩選的五肽CREKA 亦能與腫瘤血管特異性結(jié)合。由于從噬菌體肽庫中獲得的特異性短肽能靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)向腫瘤，故將其與顯像劑、藥物等耦聯(lián)起來，既可以早期地診斷腫瘤，又可以在顯著抑制腫瘤生長的同時(shí)，高效地減少傳統(tǒng)化療藥的不良反應(yīng)。目前，能與高表達(dá)于腫瘤新生血管的整合素αvβ3特異性結(jié)合的西侖吉肽在治療膠質(zhì)瘤的應(yīng)用中已完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但試驗(yàn)以失敗告終。通過篩選腫瘤血管特異性結(jié)合肽來靶向治療腫瘤的路徑雖好，但仍面臨免疫原性、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、患者間的差異性等問題。

3 結(jié) 語

通過噬菌體肽庫技術(shù)獲得的多肽被修飾后可作為藥物運(yùn)輸?shù)妮d體、成像的探針或兼兩者為一體的多功能的納米顆粒，這種納米顆粒具有更強(qiáng)的腫瘤穿透能力，更高負(fù)荷的藥物運(yùn)載能力，更多的成像信息及較低的毒性［27-28］。用噬菌體肽庫技術(shù)獲得的靶向載體雖優(yōu)點(diǎn)繁多，但要使得從肽庫中獲得的短肽正式應(yīng)用于臨床還要克服很多困難。該技術(shù)今后要解決的問題主要有以下幾方面：（1）盡量增加肽庫的多樣性；（2）盡量降低多肽的免疫原性；（3）盡量提高噬菌體的轉(zhuǎn)染率；（4）進(jìn)一步提高展示多肽的靶向性；（5）如何在篩選過程中盡量減少對(duì)靶分子或靶細(xì)胞的天然構(gòu)象的影響。該技術(shù)在腫瘤方面的應(yīng)用目前還主要處在實(shí)驗(yàn)研究階段，故獲得能用于臨床的高效的腫瘤靶向短肽任重道遠(yuǎn)。隨著噬菌體展示肽庫技術(shù)的發(fā)展和完善，其在腫瘤靶向載體的研究領(lǐng)域必將會(huì)帶來更大的推動(dòng)作用。

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