黃馨瑩，朱文瑞，陳 高，吳巧鳳

（浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州 310053）

土香薷總黃酮的含量測定及體外抗氧化作用研究

黃馨瑩，朱文瑞，陳 高，吳巧鳳

（浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州 310053）

采用鋁鹽比色法，對土香薷藥材的總黃酮含量進行了研究；以VC為陽性對照，采用DPPH法、Fent on法和FRAP法，對土香薷總黃酮對DPPH自由基、羥基自由基的清除能力和對Fe2+離子的還原能力進行了研究。結(jié)果表明：土香薷總黃酮含量為52.2 mg/g。土香薷總黃酮對DPPH自由基和羥基自由基具有較好的清除能力，其清除率的IC50分別為102.14 μg/mL和26.33 μg/mL；對Fe2+離子具有較強的還原能力。土香薷總黃酮含量較高，且具有較好的抗氧化活性。

土香薷；總黃酮；含量測定；體外抗氧化

土香薷Origanum vulgare L.為唇形科牛至屬植物，又名小葉薄荷、野荊芥等，全草入藥[1]，其性味辛而微溫，具有清熱解表、理氣化濕等功效；臨床用于治療傷風感冒、發(fā)熱、嘔吐、急性胃腸炎及腹瀉等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，土香薷主含揮發(fā)油、黃酮類、脂肪酸及多糖等化學成分[3]，且具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎止瀉等藥理作用[2]。

黃酮類化合物為廣泛存在于植物中的多酚性成分，具有較強的清除自由基能力，能抑制細胞氧化損傷[4]。土香薷的研究當前主要集中于揮發(fā)油部位[5-7]，土香薷另含槲皮素、山奈酚、木犀草素等黃酮類成分[5]，但有關(guān)土香薷總黃酮的含量及抗氧化作用研究未見報道。故本文擬采用鋁鹽比色法，測定土香薷總黃酮的含量，進一步考察其對DPPH自由基、OH自由基的清除能力和對Fe2+離子還原能力，評價其體外抗氧化活性，為土香薷的進一步開發(fā)研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尤尼柯(上海)有限公司UV-2600a型紫外可見分光光度計；北京賽多利斯天平有限公司BSA124S-CW電子天平。

1.2 試藥

土香薷(產(chǎn)地：廣西，批號:131022)，購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，并經(jīng)本校中藥資源與鑒定教研室俞冰副教授鑒定為唇形科植物土香薷的干燥地上部分；蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號: 100080-200707)，1,1-二苯基-2-苦肼基(Sigma公司，批號:S44112-089)；維生素C(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號:20120333)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 土香薷總黃酮的含量測定

2.1.1 土香薷總黃酮提取液的制備

取土香薷藥材，粉碎，過40目篩，50℃烘至恒量。稱取土香薷藥材粗粉10.0 g，加20倍量60%乙醇溶液，于85℃加熱回流提取3次，每次2 h。合并3次濾液，濃縮，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%的乙醇定容至刻度，得土香薷總黃酮提取液，備用。

2.1.2 標準品溶液的制備

精密稱取烘至恒量的蘆丁標準品9.96 mg，以60%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，定容，搖勻，得濃度為0.1992 mg/mL的蘆丁標準品溶液，備用。

2.1.3 線性關(guān)系考察

根據(jù)文獻[8]的方法，準確吸取標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇至8.0 mL，加10%NaNO3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，于510 nm處分別測定吸光度，同行試劑空白。得吸光度Y與濃度X(mg/mL)的回歸方程為：Y=12.149X+0.003 4(r=0.999 4)。表明：在0.015 9～0.055 8 mg/mL濃度范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取標準品溶液4.0 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，連續(xù)測定6次吸光度，計算得RSD為1.02%，說明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液1.0 mL，入25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，分別在顯色后0、5、15、30、45、60、90min時測定吸光度，計算得RSD為1.79%，說明樣品在顯色后1.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗

取同一批土香薷藥材粗粉，按“2.1.1”平行制備6份供試品溶液，測定吸光度，計算得RSD為1.20%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收試驗[9]

精密稱取9份已知總黃酮含量的土香薷粗粉，每份1.0 g，分別精密加入總黃酮含量的80%、100%、120%的蘆丁標準品各3份，按“2.1.1”制備供試品溶液，測定吸光度，由回歸方程計算總黃酮含量，計算得平均回收率為99.95%（RSD=1.94%）。加樣回收率試驗結(jié)果見表1，如下圖。

表1 加樣回收率試驗（n=9）Tab.1 Recovery test（n=9）

2.1.8 總黃酮的含量測定

取同一批土香薷藥材粗粉，按“2.1.1”平行制備3份供試品溶液，測定吸光度，由回歸方程計算得到土香薷中總黃酮含量為52.2 mg/g。

2.2 體外抗氧化能力測定

2.2.1 清除羥基自由基(·OH)能力測定

將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為20、30、40、50、60、120、150 μg/mL的溶液，分別取稀釋液1 mL，置具塞試管中，依次加1 mL 6 mmol/ L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，混勻，靜置10 min；再各加1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，混勻，靜置30 min，于510 nm處測定吸光度。以相同濃度的抗壞血酸(Vc)溶液作為陽性對照。按李彩霞等[9]所述方法計算出·OH清除率，并作VC和土香薷總黃酮對羥基自由基清除作用圖（見圖1）。

圖1 VC和土香薷總黃酮對羥基自由基清除作用的結(jié)果圖Fig.1 VC and Origanum vulgare L flavonoids on hydroxyl radical scavenging effect of the results of FIG.

由圖1可知，在20～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，土香薷總黃酮的清除·OH能力與濃度呈正相關(guān)，土香薷總黃酮和Vc對·OH清除率的IC50分別為102.14 μg/mL和37.78 μg/mL，證明土香薷總黃酮提取液具有一定的·OH清除作用，但效果不及Vc。實驗測得土香薷總黃酮清除·OH能力的IC50為102.14 μg/mL。

2.2.2 對DPPH的清除作用

將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為6、12、18、24、36、40 μg/mL的濃度，各取5 mL于具塞試管中，加入等體積濃度為0.1 mmo1/L的DPPH溶液，室溫避光反應30 min，同時以無水乙醇為空白，于517 nm波長處測定吸光值。以相同濃度的抗壞血酸(Vc)溶液作為陽性對照。按王曉波等[10]所述方法計算出DPPH自由基清除率。并作VC和土香薷總黃酮提取液對DPPH自由基清除作用的結(jié)果圖（見圖2）。

圖2 VC和土香薷總黃酮對DPPH自由基清除作用的結(jié)果圖Fig.2 VC and Origanum vulgare L flavonoids on DPPH radical scavenging effect of the results of FIG.

由圖2的可知，在6～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)，土香薷總黃酮清除DPPH能力隨濃度增大而增大，呈一定的量效關(guān)系，但弱于相同濃度的Vc。當濃度為40 μg/mL時，Vc的清除率為96.33%，而土香薷總黃酮的清除率為78.44%。實驗測得土香薷總黃酮清除DPPH能力的IC50為26.33 μg/mL。

2.2.3 對FRAP還原能力的作用

[11]的方法,將土香薷提取液稀釋成含總黃酮濃度為10、20、50、100、125、150、200 μg/mL的濃度，分別取稀釋液0.3 mL于具塞試管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.6)和1.5 mL 1%K3Fe(CN)6溶液，50℃水浴20 min，取出快速冷卻，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液 (TCA)，混勻后加入2.5 mL蒸餾水及0.1 mL 0.1%FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min后，700 nm處測定其吸光度(以60%乙醇代替樣品的混合液作參比溶液)，并以相應濃度的Vc作陽性對照。并作VC和土香薷總黃酮對FRAP還原能力結(jié)果圖（見圖3）。

由圖3可知，Vc和土香薷總黃酮對Fe2+的還原能力隨著濃度增大而增強，在實驗濃度范內(nèi)，均與濃度呈一定的量效關(guān)系。若以反應體系吸光度值Y與樣品濃度X進行回歸分析，可得土香薷總黃酮的回歸方程為Y=0.002X+0.289 9(R=0.9951)；Vc的回歸方程為Y=0.002X+0.162 6(R=0.9755)。當土香薷總黃酮濃度為125 μg/mL時，其對Fe2+的還原能力約與52 μg/mL的VC溶液相當。

圖3 VC和土香薷總黃酮對FRAP還原能力的結(jié)果圖VC and Origanum vulgare L flavonoids on FRAP reducing ability results in Fig.

3 討論

3.1 Harman提出的衰老自由基學說認為，隨著年齡的增長，機體器官組織的衰退性變化是由自由基的副作用引起的[12]，機體中過量的自由基會引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA鏈斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細胞解體乃至機體死亡[13]。本文對土香薷總黃酮進行了體外抗氧化作用研究，實驗結(jié)果表明，土香薷總黃酮能有效清除·OH和DPPH·兩種自由基，可增強Fe2+的還原能力，顯示土香薷總黃酮有較強的體外抗氧化作用。本文研究為土香薷總黃酮體外抗氧化能力的評價提供了參考，為土香薷的進一步開發(fā)提供了依據(jù)。

3.2 項目組前期對土香薷總黃酮的最優(yōu)提取工藝進行了考察[14]，在此基礎上，采用鋁鹽比色法測定了土香薷總黃酮的含量（52.2 mg/g），顯示土香薷中含有豐富的黃酮類成分，為土香薷活性成分的研究奠定了基礎。

3.3 本文僅對土香薷總黃酮的體外抗氧化活性進行了研究，但其抗氧化的活性成分及作用機制有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:71.

[2]李俊杰,李蓉濤.牛至的研究現(xiàn)狀[J].光譜實驗室,2013,30(1):171-174.

[3]郭雨姍,王國才,王春華,等.牛至的化學成分研究[J].中國藥學雜志,2012,47(14):1 109-1 113.

[4]王曉波,李金芳,王 梅,等.山竹殼總黃酮抗氧化及抑制亞硝化作用研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(6):9-10.

[5]LIU Hongbing,ZHENG Anmin,LIU Huili,et al.Identifiearion of Three Novel Polyphenolic Compounds,Origanine A-C,with Unique Skeleton from Origanum vulgare L.Using the Hyphenated LC-DAD-SPE-NMR/MS Methods[J].J Agric Food Chem, 2012,60(1):129-135.

[6]許 琳,鐘綺萍.天然植物抗菌藥物牛至油概述[J].國外畜牧學：豬與禽,2013,33(3):54-57.

[7]霍務貞,衛(wèi)世杰,袁旭江,等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析茵陳與牛至揮發(fā)油的化學成分 [J].廣東藥學院學報,2010,26(5): 492-496.

[8]張縱圓,彭 秧.葡萄葉中總黃酮的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化作用研究[J].中成藥,2009,31(2):292-293.

[9]李彩霞,李復興,李 鵬,等.國槐葉黃酮的抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(5):676-680.

[10]王曉波,何曉燕,王 梅,等.火龍果皮總黃酮提取與體外抗氧化作用研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(11):157.

[11]Wannes W A,Mhamdi B,Sriti J,et al.Antioxidant activities of the essential oils and methanol extracts from myrtle(Myrtus communis var.italica L.)leaf,stem and flower[J].Food and chemical toxicology,2010,48(5):1 362-1 370.

[12]趙保路.自由基、營養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學報,2010,26(1):2 6-30.

[13]高健美,陸國輝,李艷茹,等.天麻素通過SIRT1/PGC-1α信號通路抗叔丁基過氧化氫誘導的HL7702細胞氧化損傷[J].中藥藥理與臨床,2014,30(4):32-35.

[14]朱文瑞,吳巧鳳,宓嘉琪,等.基于遺傳算法的土香薷總黃酮提取工藝優(yōu)化研究 [J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2014,38(10): 1 207-1 211.

Stduy on Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Origanum vulgare L.in Vitro

HUANG Xin-ying,ZHU Wen-rui,CHEN Gao,et al
(Pharmaceutical College,Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Hangzhou 310053)

Using NaNO2-Al(NO3)3colorimetric method,to establish a method for determination of total flavonoid content in Origanum vulgare L.in herbs.Using ethanol extraction method to extract total flavonoids from Origanum vulgare L.,to prepare dry extract total flavonoids,and to study on the activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.to eliminate hydroxyl free radical(OH)and the reducing power,with Vc as positive control.The experiment result shows the total flavonoids from Origanum vulgare L was 52.2mg/g.The content of total flavonoids from Origanum vulgare L.exhibited good DPPH radical and good Fe2+reducing power.The median inhibitory concentration(IC50)of scavenging hydroxyl radical and DPPH radical were 102.14 μg/mL and 26.33 μg/mL，respectively.The antioxidant activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.in vitro is strong.

Origanum vulgare L.;total flavonoids;determination;Antioxidant activity in vitro

R284.2

A

1008－830X(2015)06－0588－05

2015-08-05

浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃資助項目(2013R410019，2014R410031)

黃馨瑩(1994-)，女，浙江義烏人，研究方向:中藥活性成分研究及新藥開發(fā).

吳巧鳳，教授，博士生導師，研究方向:中藥活性成分研究及新藥開發(fā).E-mail:wqfyjm@sina.com