馬 容，康 波，姜冬梅，何 琿

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安 625014)

產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期鵝HPG軸OAZ1和OAZ2基因表達(dá)的研究

馬 容，康 波，姜冬梅，何 琿

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安 625014)

【目的】 探討產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期鵝HPG軸中OAZ1和OAZ2基因表達(dá)的差異?！痉椒ā?選取健康的產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝母鵝各3只，采集下丘腦、垂體和卵巢組織樣品，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2基因的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】 在產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢組織中，OAZ1和OAZ2基因均有表達(dá)，并且產(chǎn)蛋期OAZ1和OAZ2表達(dá)量均極顯著高于產(chǎn)蛋前期(P<0.01)，產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢中OAZ1的表達(dá)量分別是產(chǎn)蛋前期的1.79倍(P<0.01)、2.96倍(P<0.01)和3.48倍(P<0.01)；產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢中OAZ2的表達(dá)量分別是產(chǎn)蛋前期的2.66倍(P<0.01)、1.38倍(P<0.01)和2.03倍(P<0.01)。【結(jié)論】OAZ1和OAZ2可在HPG軸的各級(jí)水平發(fā)揮其調(diào)控鵝繁殖過(guò)程的功能，OAZ1主要參與卵巢功能的調(diào)控，而OAZ2主要參與下丘腦功能的調(diào)控。

四川白鵝；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶1(OAZ1)；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶2(OAZ2)；多胺；下丘腦-垂體-性腺軸；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

多胺作為廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體中的一類低分子脂肪族陽(yáng)離子化合物，在細(xì)胞周期、基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)多胺水平的穩(wěn)定有重要作用，其活性可在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后被精確調(diào)控[3]。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶(Ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)是多胺誘導(dǎo)的一種能負(fù)調(diào)控細(xì)胞多胺水平的蛋白酶[4]。研究表明，目前已發(fā)現(xiàn)的OAZ家族共包括4個(gè)成員，即OAZ1、OAZ2、OAZ3和OAZ4。OAZ1作為OAZ家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員，是目前研究最為廣泛的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶。研究發(fā)現(xiàn)，OAZ1可與ODC結(jié)合并介導(dǎo)26S蛋白酶體降解ODC，從而負(fù)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多胺水平[5]。OAZ1還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響細(xì)胞凋亡；此外，OAZ1還具有抗腫瘤效應(yīng)[6]。近年來(lái)的研究表明，OAZ1還可參與動(dòng)物繁殖的調(diào)節(jié)，An等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多胎(3羔)奶山羊卵巢組織中OAZ1基因的表達(dá)量顯著高于單胎奶山羊，提示OAZ1可能促進(jìn)奶山羊的卵泡發(fā)育和排卵。而在家禽方面，Kang等[8]研究表明，產(chǎn)蛋期籽鵝卵巢組織中OAZ1表達(dá)量顯著高于產(chǎn)蛋前期，提示OAZ1可能參與鵝產(chǎn)蛋過(guò)程的調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于OAZ1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抗腫瘤方面的研究很多，而關(guān)于OAZ1調(diào)節(jié)機(jī)體多胺水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖方面的研究甚少，尤其是OAZ1對(duì)鵝繁殖方面的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。OAZ2與OAZ1的結(jié)構(gòu)和組織分布相似，但表達(dá)量相對(duì)較少。在體外，OAZ2不能促使蛋白酶體降解ODC，但仍能抑制ODC活性和多胺的攝??；在體內(nèi)，OAZ2不僅能促使蛋白酶體降解ODC，也能抑制ODC活性及動(dòng)物對(duì)多胺的攝取[9]?？傊琌AZ2也可通過(guò)降低ODC活性從而降低多胺的水平[10]。劉夢(mèng)瑤等[11]研究表明，在B16-F1細(xì)胞中高表達(dá)OAZ2將使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，說(shuō)明OAZ2也能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。然而，OAZ2是否也具有調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖功能的作用尚不清楚。動(dòng)物生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持受到下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)的調(diào)控。因此，本研究定量檢測(cè)四川白鵝產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2基因的表達(dá)量，旨在闡明OAZ1和OAZ2在四川白鵝不同繁殖階段HPG軸的表達(dá)差異，為探明OAZ1和OAZ2基因功能和提高鵝產(chǎn)蛋性能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選取健康的產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝母鵝各3只，采集下丘腦、垂體和卵巢組織樣品，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理實(shí)驗(yàn)室克隆獲得的OAZ1和OAZ2編碼區(qū)序列，應(yīng)用Oligo 6.0和Primer 5.0設(shè)計(jì)OAZ1和OAZ2基因特異性引物；同時(shí)根據(jù)NCBI中原雞和火雞的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-actin的引物。引物由上海生工合成，其序列信息見(jiàn)表1。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

根據(jù)Trizol試劑盒的操作說(shuō)明，提取四川白鵝產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期各組織樣品的總RNA。取5 μL總RNA樣品，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。參照M-MLV first strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，先將總RNA 5 μL、 1 μL Oligo (dT)18(500 μg/mL)、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、滅菌去離子水5 μL于70 ℃反應(yīng)5 min，然后迅速置于冰上2 min；再加入4 μL的5×Buffer、1 μL的RNasin(40 U/μL)和2 μL的DTT(0.1 mol/L)混勻，37 ℃ 2 min，之后加入1 μL的M-MLV(200 U/μL)混勻，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，然后終止反應(yīng)，將獲得的cDNA模板保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 目的片段的PCR擴(kuò)增

以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體積20 μL，滅菌去離子水8.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)10.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用于電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小與目的片段是否一致。

1.5 OAZ1和OAZ2表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為50 μL：模板cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase Free水補(bǔ)充至50 μL。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 s；94 ℃變性5 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s(采集熒光信號(hào))，45個(gè)循環(huán)，并繪制溶解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，用β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢組織OAZ1和OAZ2的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件中的MEANS程序進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，用ANOVA程序進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較。OAZ1和OAZ2的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川白鵝總RNA提取及目的基因的PCR擴(kuò)增

圖1顯示，四川白鵝卵巢總RNA的28S和18S rRNA條帶清晰，并且28S和18S rRNA的條帶亮度比值為(1～2)∶1。下丘腦和垂體組織總RNA質(zhì)量與卵巢一致(圖略)。圖2顯示，以卵巢cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳獲得了β-actin(222 bp)、OAZ1(142 bp)、OAZ2(142 bp)的基因片段，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致，而且特異性較好。下丘腦和垂體組織的PCR結(jié)果與卵巢一致(圖略)。結(jié)果表明，試驗(yàn)合成的不同組織的cDNA可以用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

圖1 四川白鵝卵巢總RNA
Fig.1 Total RNA in ovary of Sichuan white goose

圖2 四川白鵝卵巢組織β-actin、OAZ1和OAZ2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Marker.DL 2000 DNA Marker
Fig.2 PCR amplification ofOAZ1,OAZ2 andβ-actingenes in ovary of Sichuan white goose

2.2 四川白鵝HPG軸中OAZ1和OAZ2基因的相對(duì)表達(dá)量

圖3顯示，產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢組織中OAZ1和OAZ2表達(dá)量均極顯著高于產(chǎn)蛋前期(P<0.01)，分別是產(chǎn)蛋前期的1.79和2.66倍；2.96和1.38倍；3.48和2.03倍。

3 討 論

動(dòng)物繁殖涉及細(xì)胞遷移、增殖、分化和死亡等過(guò)程。多胺廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)。Pietila等[12]研究表明，適宜濃度的多胺可以促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育，而多胺過(guò)量將抑制卵泡的發(fā)育。多胺可通過(guò)與動(dòng)物體內(nèi)的多種生殖激素作用，從而參與動(dòng)物繁殖功能的調(diào)節(jié)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦OAZ1和OAZ2的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可能通過(guò)抑制ODC活性，降低下丘腦中多胺的生物合成，進(jìn)而參與四川白鵝繁殖功能的調(diào)節(jié)。研究表明，由卵巢分泌的雌激素需通過(guò)其受體的介導(dǎo)，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，而雌激素受體在包括下丘腦在內(nèi)的腦內(nèi)分布廣泛[14]。天然多胺可以促進(jìn)雌激素受體和雌激素應(yīng)答元件之間的識(shí)別[13]。故筆者推測(cè)下丘腦中高水平表達(dá)的OAZ1和OAZ2可降低多胺的合成，從而影響雌激素及其應(yīng)答元件之間的識(shí)別，進(jìn)而參與調(diào)控四川白鵝的繁殖功能。

促性腺激素(促黃體生成素和促卵泡激素)對(duì)卵泡發(fā)育及排卵有重要的調(diào)控作用。在大鼠卵巢中，促性腺激素可誘導(dǎo)ODC的活性[15]。在豬的卵泡顆粒細(xì)胞中，促性腺激素能通過(guò)cAMP上調(diào)ODC水平[16]。本研究結(jié)果表明，產(chǎn)蛋期四川白鵝垂體組織中OAZ1和OAZ2的表達(dá)量均極顯著高于產(chǎn)蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可在垂體通過(guò)調(diào)節(jié)HPG途徑參與調(diào)控四川白鵝的繁殖功能，其可能的機(jī)制是：高水平的OAZ1和OAZ2均能抑制ODC活性，從而使體內(nèi)多胺水平降低，影響垂體促性腺激素的分泌，進(jìn)而調(diào)控四川白鵝的繁殖功能。

研究表明，處于發(fā)育時(shí)期的大鼠卵巢中ODC維持著較高的生物活性[17]。Bastida等[18]研究發(fā)現(xiàn)，促黃體生成素和人絨毛膜促性腺激素可提高雌鼠竇狀卵泡顆粒細(xì)胞中的ODC活性，表明ODC對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育具有調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，OAZ1和OAZ2在產(chǎn)蛋期四川白鵝的卵巢組織中的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋前期，這與Kang等[8]的研究結(jié)果相似，推測(cè)產(chǎn)蛋期卵巢組織中高表達(dá)的OAZ1和OAZ2可能抑制了ODC的活性，從而抑制多胺的生物合成，進(jìn)而影響四川白鵝卵泡細(xì)胞的發(fā)育，提示OAZ1和OAZ2在產(chǎn)蛋期四川白鵝卵巢組織中的高水平表達(dá)可能與鵝的產(chǎn)蛋性能有關(guān)。宿甲子等[19]研究也表明，籽鵝產(chǎn)蛋期卵巢中OAZ1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于產(chǎn)蛋前期，提示本研究中OAZ1可能通過(guò)調(diào)控卵泡的發(fā)育來(lái)影響四川白鵝的繁殖功能。另有研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)能夠調(diào)控雌性哺乳動(dòng)物的生殖能力，尤其是參與哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)生[20]。BMPs的作用可以被靶細(xì)胞中的下游信號(hào)分子Smad6抑制[21]。Ku等[22]研究表明，Smad6的轉(zhuǎn)錄激活需要OAZ作為輔因子，OAZ通過(guò)與Smad1/4形成復(fù)合物從而激活Smad6的轉(zhuǎn)錄，最終抑制BMPs通路。由此推測(cè)，在四川白鵝產(chǎn)蛋期卵巢中，高水平表達(dá)的OAZ1和OAZ2可能通過(guò)激活Smad6的轉(zhuǎn)錄，從而抑制BMPs通路，最終調(diào)控鵝卵泡的發(fā)育，影響四川白鵝的繁殖功能。

4 結(jié) 論

四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢中均表達(dá)OAZ1和OAZ2，并且產(chǎn)蛋期下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2的表達(dá)量均極顯著高于產(chǎn)蛋前期，說(shuō)明OAZ1和OAZ2可在HPG軸的各級(jí)水平參與動(dòng)物繁殖功能的調(diào)節(jié)，OAZ1主要參與卵巢功能的調(diào)控，而OAZ2主要參與下丘腦功能的調(diào)控。

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Expressions ofOAZ1 andOAZ2 genes in HPG axis of goose at pre-laying and laying stages

MA Rong,KANG Bo,JIANG Dong-mei,HE Hui

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study aimed to explore the differences in expressions of ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1) and ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2) genes in the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of Sichuan white geese at pre-laying and laying stages.【Method】 Healthy female Sichuan white geese at pre-laying and laying stages (n=3,respectively) were selected,and hypothalamic,pituitary and ovary tissues were collected.Total RNA was extracted and cDNA was synthesized.The expression levels ofOAZ1 andOAZ2 in hypothalamus,pituitary gland and ovary samples were determined by quantitative real-time PCR.【Result】OAZ1 andOAZ2 genes expressed in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of Sichuan white goose at both pre-laying and laying stages, and the expressions ofOAZ1 andOAZ2 at laying period were significantly higher than at pre-laying period (P<0.01).The expression levels ofOAZ1 mRNA in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of geese at laying stage were 1.79 (P<0.01),2.96 (P<0.01) and 3.48 (P<0.01) times of those for geese at pre-laying stage,respectively.The levels ofOAZ2 mRNA expression in hypothalamus,pituitary and ovarian tissue of geese at laying stage were 2.66 (P<0.01),1.38 (P<0.01) and 2.03 (P<0.01) times of those in geese at pre-laying stage,respectively.【Conclusion】OAZ1 andOAZ2 mediated the biological function of HPG axis.OAZ1 may play a more important role in ovary whileOAZ2 may play a more important role in hypothalamic.

Sichuan white goose;ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1);ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2);polyamines;hypothalamic-pituitary-gonadal axis;quantitative real-time PCR

2013-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201798)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20105103120003)

馬 容(1990-)，女，四川內(nèi)江人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物卵泡發(fā)育機(jī)理研究。E-mail:marong53@sina.com

姜冬梅(1978-)，女，黑龍江海林人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事環(huán)境生理研究。E-mail:jiangdm9277@163.com

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.033

S835;Q786

A

1671-9387(2015)02-0044-05

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