胡 昌 宋 明 河南省濟(jì)源市畜牧局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 459000

1 材料和方法

1.1 材料

（1）試驗(yàn)菌株。8 株豬大腸桿菌（E.coil）分離自大腸菌感染的豬體，8 株豬鏈球菌株分離自感染的病豬，均來源于河南省內(nèi)豬場(chǎng)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室自行分離保存。

（2）試劑和藥物。抗菌肽和牛肉膏（生化試劑）購(gòu)自北京奧星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20070720；蛋白胨（生化試劑）購(gòu)自北京奧星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20081102；氯化鈉（分析純）購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號(hào)20080924；磷酸氫二鉀（分析純）購(gòu)自上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20080602。

（3）儀器。電熱溫恒溫培養(yǎng)箱：HG303-4 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠制造；凈化工作臺(tái)：SW-CT-1C 蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；手提式不銹鋼蒸汽消毒器：YX280B上海三申醫(yī)療器械有限公司；雙目生物顯微鏡：CX21日本奧林巴斯。

1.2 方法

（1）菌種的復(fù)蘇和純化。將實(shí)驗(yàn)室保存豬源大腸桿菌的甘油菌種劃線接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，豬鏈球菌接種于血平板，37℃培養(yǎng)24 小時(shí)，挑取單個(gè)菌落，涂片染色鏡檢，觀察細(xì)菌的大小和形態(tài)，選取典型菌體進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）細(xì)菌接種量的確定。用普通肉湯培養(yǎng)基將抗菌肽原液倍比稀釋為1／10 倍~1／2560 倍9 個(gè)濃度，加入滅菌試管中。兩種細(xì)菌每組隨機(jī)選取4 株，用生理鹽水將豬源大腸桿菌和豬鏈球菌以鏡檢計(jì)數(shù)方式配成1×107cfu·mL、1×106cfu·mL、1×105cfu·mL、1×104cfu·mL4 種濃度的細(xì)菌懸液，分別接種于含不同藥物梯度的普通肉湯培養(yǎng)基中。另做不含藥物的培養(yǎng)基，接種菌懸液，作為生長(zhǎng)菌的空白對(duì)照。于37℃培養(yǎng)24 小時(shí)觀察各菌株的生長(zhǎng)情況，以未有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為MIC。

（3）試管稀釋法對(duì)最小抑菌濃度（MIC）的確定。取抗菌肽原液0.2mL 以相應(yīng)的普通肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋成1／10 倍、1／20 倍、1／40 倍、1／80 倍、1／160 倍、1／320 倍、1／640 倍、1／1280 倍和1／2560 倍9 個(gè)濃度移入小試管，兩種細(xì)菌每組隨機(jī)選取4 株，用生理鹽水將大腸桿菌和豬鏈球菌菌株分別以鏡檢計(jì)數(shù)法方式配成1×105cfu·mL 的菌懸液，分別在不同的藥物梯度試管中加入20mL 菌液，另做不含藥物的培養(yǎng)基接種菌懸液，作為生長(zhǎng)菌的空白對(duì)照。樣品于37℃培養(yǎng)，36h 觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，分別測(cè)定菌種的MIC。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌接種量的確定

由表l 看出 ，在相同培養(yǎng)條件下，抗菌肽的最小抑菌濃度隨細(xì)菌濃度的增加而不斷提高，在細(xì)菌濃度范圍為1×104cfu·mL 和1×l05cfu·mL 之間為規(guī)則上升，之后MIC 的變化不規(guī)則。為了獲得較好的數(shù)值并獲得較一致的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)將菌株接種濃度確定為1×105cfu·mL 進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

表1 不同的細(xì)菌濃度對(duì)抗菌肽最小抑菌濃度的影響

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

表2 抗菌肽對(duì)豬源大腸桿菌和豬鏈球菌最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

采用普通肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋法，結(jié)果測(cè)得抗菌肽對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度和對(duì)豬鏈球菌的抑菌作用?？咕膶?duì)大腸桿菌的MIC 為原液的1／160~1／80 倍之間?？咕膶?duì)豬鏈球菌的MIC 明顯小于大腸桿菌的MIC 為1／1280~1／640 倍之間，只表明抗菌肽對(duì)豬鏈球球菌的體外抑菌效果明顯優(yōu)于大腸桿菌。從表2 看出，抗菌肽對(duì)豬源的大腸桿菌和豬鏈球球菌的抑菌作用有較大差異，對(duì)大腸桿菌的MIC 較高，為原液的1／160~1／80 倍之間，而對(duì)豬鏈球球菌的MIC 較低，為1／1280~1／640 倍之間。

3 討論

3.1 關(guān)于抗菌肽對(duì)豬源大腸桿菌和豬鏈球菌最小抑菌濃度(MIC)

培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌和豬鏈球菌的MIC 與接種細(xì)菌的濃度和培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)菌量，本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)中通過測(cè)定不同細(xì)菌濃度對(duì)抗菌肽最小抑菌濃度的影響。抗菌肽對(duì)豬源大腸桿菌和豬鏈球菌的抑制作用有較大的差異，究及原因可能與大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌有關(guān)，兩種細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有較大的差異，因此對(duì)抗菌肽的耐受性不同。

3.2 關(guān)于抗菌肽在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

不同來源和不同種類的抗菌肽抗菌特征具有相似性，即具有廣譜抗菌活性，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。研究者發(fā)現(xiàn)抗菌肽可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高動(dòng)物抗病能力，不易產(chǎn)生耐藥性。此外，結(jié)合基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也是動(dòng)物養(yǎng)殖的一種新途徑。Yarus 用顯微注射法將牛氣管AMP 基因轉(zhuǎn)入小鼠，轉(zhuǎn)基鼠成功地表達(dá)了牛氣管AMP，鼠乳中的牛氣管AMP 對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性。可見抗菌肽轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有明顯增強(qiáng)抗病原微生物的能力，這在動(dòng)物養(yǎng)殖中具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)昆蟲抗菌肽被認(rèn)為最具有發(fā)展前景的綠色飼料添加劑?？股仫暳咸砑觿┑氖褂脟?yán)重破壞了動(dòng)物腸道的微生物平衡，并且容易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，使生態(tài)環(huán)境中的細(xì)菌在與動(dòng)物接觸中產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健康，進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)環(huán)境。

隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、抗菌肽作用機(jī)制及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，應(yīng)用抗菌肽作為飼料添加劑，可克服耐藥菌株的產(chǎn)生，而抗菌肽成分為易吸收的氨基酸，動(dòng)物通過飼喂添加抗菌肽的飼料，可增加其對(duì)疾病的抵抗力，促進(jìn)生長(zhǎng)。因此用基因工程方法生產(chǎn)特異性抗菌肽添加劑，或通過日糧調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)，從而達(dá)到畜產(chǎn)品無抗生素化，提高我國(guó)畜產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。當(dāng)然抗菌肽作為飼料添加劑的研究還處于探索階段，要形成成熟的技術(shù)、大規(guī)模的應(yīng)用到動(dòng)物生產(chǎn)中還有很多問題需要解決。抗菌肽的種類很多，哪些種類作為飼料添加劑效果較好而且又比較經(jīng)濟(jì)，不同種類的抗菌肽之間是否有相互作用，也有待于進(jìn)一步研究。由于抗菌肽的分子小，直接提取天然抗菌肽時(shí)，分離提純存在一定的困難，故化學(xué)合成和基因工程法成為獲得抗菌肽的主要手段，但是化學(xué)合成抗菌肽成本很高。通過基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因時(shí)，容易被蛋白酶降解，表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)宿主有害，需要用脂質(zhì)包被或?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)修飾來保護(hù)，因此還需對(duì)它的釋放機(jī)制、受體結(jié)合降解活性及其類似物的結(jié)構(gòu)與活性等進(jìn)行研究。