李興太，韋豪華，張紅玲，孫海波，蘇亞茹

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116605)

近年發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)參與了100 多種人類疾病，如心血管疾病、糖尿病、慢性炎癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥的發(fā)病機(jī)制及免疫和衰老過(guò)程［1-4］。線粒體是機(jī)體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)的樞紐和核心，最主要功能就是通過(guò)氧化磷酸化(OXPHOS)提供生命活動(dòng)所需能量——三磷酸腺苷(ATP)。線粒體又是ROS 損傷最敏感的靶部位，被稱為衰老的“生物鐘”，2013 年線粒體功能障礙被Cell 雜志列為衰老的九大標(biāo)志之一［5］。主要由線粒體ROS 引起的蛋白質(zhì)、核酸與脂質(zhì)氧化，是決定健康和壽命的關(guān)鍵因素［6］。ROS 生成與清除之間保持平衡(氧化還原平衡)對(duì)健康具有重要意義［7］。近幾十年的研究已經(jīng)凸顯出ROS 在健康和疾病中新的角色。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“氣者，人之根本也”;“百病皆生于氣也”;氣與健康、疾病和生命關(guān)系極為密切。隨著年齡的增長(zhǎng)氣虛呈逐年加重之勢(shì)，中國(guó)的中老年人中一半以上表現(xiàn)為氣虛，氣虛亦是多種病變的常見病因，補(bǔ)氣是治療氣虛之大法，補(bǔ)氣在中醫(yī)養(yǎng)生及臨床上占有重要地位。LI Xing -Tai 發(fā)現(xiàn)，氣虛導(dǎo)致顯著的細(xì)胞內(nèi)ATP 水平下降及一磷酸腺苷(AMP)水平上升，受損的線粒體ATP 生成是氣虛的關(guān)鍵特性，氣虛可導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，提出并實(shí)驗(yàn)證明“補(bǔ)氣作用是通過(guò)改善線粒體能量代謝實(shí)現(xiàn)的”［8］。

黃芪(Astragalus membranaceus)和黨參(Codonopsis pilosula)是補(bǔ)氣藥的代表。黃芪不僅有補(bǔ)氣、“扶正”作用，而且氣血陰陽(yáng)兼而有之，故有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱。黨參補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津，為滋養(yǎng)脾胃之要藥，用于神疲力乏、脾胃虛弱等癥。黨參能增強(qiáng)線粒體功能并改善能量代謝，對(duì)解除運(yùn)動(dòng)性疲勞有重要作用［9］。我們的前期研究證明，黃芪和黨參均能顯著增加鼠肝細(xì)胞ATP 含量、腺苷酸池(TAP)與腺苷酸能荷(AEC)水平［10］;黃芪多糖能通過(guò)清除ROS、抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)及提高抗氧化酶活力來(lái)保護(hù)線粒體免受損傷，且能通過(guò)提高細(xì)胞的生物能學(xué)而改善線粒體功能［11-12］。黃芪補(bǔ)氣之功最優(yōu)，常與黨參同服，則補(bǔ)氣之力更佳，故選黃芪與黨參配伍以加強(qiáng)補(bǔ)氣之力，組方制成“芪參補(bǔ)氣藥茶”，定會(huì)受到廣大消費(fèi)者的青睞，但其作用機(jī)理尚不清楚。藥茶，藥以茶而現(xiàn)，茶以藥為用，說(shuō)明藥、茶原為一類，其功能優(yōu)勢(shì)可以互補(bǔ)。

本實(shí)驗(yàn)從清除線粒體ROS 視角研究芪參補(bǔ)氣藥茶的作用機(jī)理，為進(jìn)一步開發(fā)利用黃芪、黨參的藥用及保健功能提供科學(xué)依據(jù)，以拓寬保健藥茶更廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

1 材料及方法

1.1 材料

黃芪采自大興安嶺林區(qū)，黨參購(gòu)自大連開發(fā)區(qū)保健大藥房。

1.2 儀器及試劑

Polystat 34 恒溫水浴鍋(美國(guó)Techne 公司);UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司);DY89 -1 型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科器研究所);XW-80A 旋渦混合器(上海精密實(shí)業(yè)有限公司)。

考馬斯亮藍(lán)G -250、吩嗪硫酸甲酯(PMS)(美國(guó)Fluka 公司);還原型輔酶Ⅰ(NADH)與氮藍(lán)四唑(NBT)(荷蘭Boehringer Mannheim 公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國(guó)Gibco 公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 方法

1.3.1 芪參補(bǔ)氣藥茶(ACT)的制備及其總黃酮與多糖含量的測(cè)定

稱取干燥黃芪粉末、黨參飲片各25 g 加入500 mL 去離子水浸泡1.0 h 后煮沸30 min，濾出煎液，然后向藥渣中加入400 mL 去離子水再煮沸20 min，得煎液，將兩次所得煎液合并濃縮至500 mL，裝瓶密封，即得到生藥質(zhì)量濃度為100 mg ·mL-1的芪參補(bǔ)氣藥茶，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品用AlCl3比色法測(cè)定ACT 總黃酮［13］;ACT 經(jīng)Sevage 試劑(氯仿與正丁醇的體積比為4∶1)除蛋白，濃縮，加入無(wú)水乙醇使其體積分?jǐn)?shù)為80 %，離心，所得沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚分別洗滌，沉淀即為ACT 總多糖，真空干燥，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品用硫酸苯酚法測(cè)定ACT 總糖和總多糖含量［14］。

1.3.2 超氧陰離子(O2·-)的測(cè)定

以NADH/PMS 為O2·-生成系統(tǒng)，以NBT 還原法測(cè)定O2·-的生成情況［15］。16 mmol·L-1的Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)中含NADH 73 μmol·L-1、NBT 50 μmol·L-1、PMS 15 μmol·L-1，空白管不加PMS，對(duì)照組不加ACT，總體積為3 mL，以空白管調(diào)零，于波長(zhǎng)560 nm 處測(cè)定吸光度，2 min 時(shí)準(zhǔn)確記錄數(shù)據(jù)，并按式(1)計(jì)算清除率(SR)，以VC 為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3 羥自由基(·OH)清除活性分析

總體積2 mL 的Fenton 反應(yīng)體系含0. 75 mmol·L-1硫酸亞鐵、0.75 mmol·L-1鄰二氮菲、150 mmol·L-1PBS 和不同濃度的ACT 或BHT、0.8 mmol·L-1H2O2。加入H2O2起始反應(yīng)，各管分別在37 ℃水浴中孵育60 min，測(cè)定波長(zhǎng)536 nm處Fe2+-鄰二氮菲復(fù)合物吸光度［16］。以BHT 為陽(yáng)性對(duì)照。按式(2)計(jì)算ACT 對(duì)·OH 的清除率。

式中，A0為對(duì)照組(加H2O2但不加ACT 和BHT)吸光度;A1為ACT 或BHT 組吸光度;A2為空白組(不加ACT、BHT 和H2O2)吸光度。

1.3.4 H2O2的測(cè)定

ACT 的H2O2清除活性按Zhao 等［17］方法測(cè)定。1.0 mL 0.1 mmol·L-1H2O2與1.0 mL 不同濃度的ACT 混合，再加入100 μL 3 %鉬酸銨，10 mL 2 mol·L-1硫酸和7.0 mL 1.8 mol·L-1碘化鉀。混合溶液用5 mmol·L-1Na2S2O3滴定至黃色消失，以BHT 為陽(yáng)性對(duì)照。按式(3)計(jì)算清除率。

式中，V0為H2O2存在時(shí)滴定對(duì)照樣品(不含ACT)使用的Na2S2O3溶液體積;V1為ACT 或BHT 存在時(shí)使用的Na2S2O3溶液體積。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 芪參補(bǔ)氣藥茶(ACT)總黃酮與總多糖的含量測(cè)定結(jié)果

研究表明:黨參主要活性成分有多糖、黃酮、酚酸等，黨參多糖具有清除超氧陰離子和羥自由基、增加SOD 并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性，其含量的高低可作為黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，多糖為黨參的主要功能因子［18-19］;黃芪主要含多糖、黃酮和皂苷等活性成分，具有增強(qiáng)免疫功能、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等活性，多糖和黃酮為其主要功能因子［20-21］。鑒于黃芪和黨參均含較多的糖類物質(zhì)(包括單糖、寡糖和多糖)，為人類營(yíng)養(yǎng)所需，其均可能參與機(jī)體的能量代謝，是發(fā)揮補(bǔ)氣作用的重要功能因子;黃酮類物質(zhì)又具有較強(qiáng)的抗氧化藥理活性;因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了ACT的總糖、總多糖及總黃酮含量作為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。取ACT 200 μL，用AlCl3比色法測(cè)定ACT 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(121 ±8.5)μg·mL-1。用硫酸苯酚法測(cè)定ACT 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(26 ±1.3)mg·mL-1，總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(12.5 ±0.8)mg·mL-1。

2.2 芪參補(bǔ)氣藥茶對(duì)O2·-、·OH 及H2O2 清除作用的影響

機(jī)體內(nèi)95 %以上的ROS 源于細(xì)胞內(nèi)氧被消耗的主要部位——線粒體，正是在此，還原性底物提供電子以形成電化學(xué)梯度，從而最終導(dǎo)致細(xì)胞的能量貨幣ATP 的生成，這是通過(guò)線粒體內(nèi)膜上一系列蛋白復(fù)合體的氧化反應(yīng)進(jìn)行的。電子從這些復(fù)合體漏出導(dǎo)致氧的單電子還原形成超氧陰離子(O2·-)——大部分ROS 的前體。歧化超氧化物生成H2O2，隨后通過(guò)Haber -Weiss反應(yīng)，O2·-與H2O2相互作用或Fenton 反應(yīng)裂解H2O2形成羥自由基(·OH)［22］。線粒體耗氧的約0.2 %通常在靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化成O2·-［23］。

與對(duì)照組相比，ACT 可一定程度清除O2·-、·OH 及H2O2三種ROS，且呈劑量- 效應(yīng)關(guān)系(見表1 -表3)，其清除O2·-作用強(qiáng)度明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照VC 組;VC 可以通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入線粒體，并抗氧化損傷以保護(hù)線粒體。其清除·OH和H2O2作用強(qiáng)度雖遠(yuǎn)不如陽(yáng)性對(duì)照BHT強(qiáng)，但BHT 為合成抗氧化劑，有一定毒性，已被限制使用。作為線粒體生物功能的后果，其總是暴露在ROS 產(chǎn)物中，并有一個(gè)復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)以抵抗被氧化。生物系統(tǒng)中氧化劑和抗氧化能力的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)且氧化還原狀態(tài)更加助氧化時(shí)，氧化應(yīng)激便會(huì)發(fā)生。因此，在線粒體氧化應(yīng)激條件下，即線粒體ROS 的生成超過(guò)抗氧化能力條件下，線粒體可能遭受對(duì)其生物分子的氧化損傷。因此，適量補(bǔ)充外源性活性氧清除劑，可預(yù)防這類損傷和病變的發(fā)生與發(fā)展。

表1 ACT 對(duì)O2· -的清除作用(n=6)

表2 ACT 對(duì)·OH 的清除作用(n=6)

表3 ACT 對(duì)H2O2 的清除作用(n=6)

3 討 論

氧化與抗氧化平衡是健康的關(guān)鍵。在低劑量時(shí)，ROS 對(duì)多種生理功能起關(guān)鍵作用，如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)及促進(jìn)抗氧化防御機(jī)制［24］。完全消除ROS 會(huì)抑制機(jī)體應(yīng)答外部應(yīng)激因素反應(yīng)的能力［25］。ROS 與抗氧化保護(hù)系統(tǒng)必須協(xié)調(diào)作用，達(dá)到氧化還原平衡狀態(tài)。ROS是一柄“雙刃劍”，其在生理濃度時(shí)廣泛參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生命過(guò)程，過(guò)量時(shí)又能引起線粒體氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生。如何保持細(xì)胞內(nèi)的氧化與抗氧化平衡(氧化還原平衡)，既不過(guò)度氧化損傷，也不過(guò)度抗氧化而影響正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對(duì)健康極為重要［7］。

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，植物性食物的健康益處可能不會(huì)歸因于某一個(gè)特定的化合物，而是歸因于整個(gè)水果和蔬菜，即其中的植物化學(xué)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)復(fù)雜的協(xié)同作用［26］。因此，本實(shí)驗(yàn)以水為溶劑(避免化學(xué)溶劑的引入)提取藥茶總活性成份，既符合傳統(tǒng)飲茶與用藥習(xí)慣，又綜合利用其中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(避免浪費(fèi))復(fù)雜的協(xié)同作用，倡導(dǎo)“傳統(tǒng)、自然、簡(jiǎn)約、有效”的藥茶養(yǎng)生保健理念。

ROS 是由分子氧還原產(chǎn)生的高反應(yīng)性分子。線粒體主要的ROS 有O2·-，·OH 和H2O2三種。這些ROS 主要是由線粒體氧化磷酸化(電子沿呼吸鏈酶?jìng)鬟f并泄漏給分子氧)生成的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪參補(bǔ)氣藥茶對(duì)三種主要ROS 的清除作用不是很強(qiáng)，說(shuō)明其具有較溫和的抗氧化作用，這可能對(duì)維持機(jī)體的氧化還原平衡具有一定作用，而強(qiáng)抗氧化劑如BHT 等則具有較大的毒性，這也許印證了古代本草著作中記載的補(bǔ)氣類中藥具有久服無(wú)毒、延年益壽的作用。ROS 也可導(dǎo)致線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化及膜通透性增加，而ACT 能夠一定程度上清除三種主要線粒體ROS，說(shuō)明其具有一定的健康益處。ACT 能通過(guò)溫和的抗氧化作用來(lái)保護(hù)線粒體，從而維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡，這是ACT 促進(jìn)健康的潛在機(jī)制。然而，其對(duì)線粒體功能影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚待進(jìn)一步研究。

［1］TAMURA M，MATSUI H，TOMITA T，et al. Mitochondrial reactive oxygen species accelerate gastric cancer cell invasion［J］. Journal of Clinical Biochemistry andNutrition，2014，54(1):12 -17.

［2］GONCHAROV N V，AVDONIN P V，NADEEV A D，et al. Reactive oxygen species in pathogenesis of atherosclerosis［J］. Current Pharmaceutical Design，2015，21(13):1134 -1146.

［3］NATHAN C，CUNNINGHAM-BUSSEL A. Beyond oxidative stress:an immunologist’s guide to reactive oxygen species［J］. Nature Reviews Immunology，2013，13(5):349 -361.

［4］LIOCHEV S I. Reactive oxygen species and the free radical theory of aging［J］. Free Radical Biology and Medicine，2013，60(10):1 -4.

［5］ LóPEZ - OTíN C，BLASCO M A，PARTRIDGE L，et al. The hallmarks of aging［J］. Cell，2013，153(6):1194 -1217.

［6］DE CAVANAGH E，INSERRA F，F(xiàn)ERDER L. Angiotensin Ⅱblockade:a strategy to slow ageing by protecting mitochondria［J］. Cardiovascular Research，2011，89(1):31 -40.

［7］李興太，紀(jì)瑩. 線粒體氧化應(yīng)激與天然抗氧化劑研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)，2015，36(7):268 -277.

［8］LI Xingtai. Investigation on the Mechanism of Qi-invigoration from a Perspective of Effects of Sijunzi Decoction on Mitochondrial Energy Metabolism［M］∥Sakagami Hiroshi. Alternative Medicine. Rijeka:InTech Publisher.2012:247 -275.

［9］李巖，武乾，林謙. 補(bǔ)氣藥黨參黃芪對(duì)慢性心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響［J］. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(7):597 -598.

［10］LI Xingtai，ZHAO Jia. An Approach to the Nature of Qi in TCM—Qi and Bioenergy［M］∥Kuang Haixue.Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine. Rijeka:InTech Publisher. 2012:79 -108.

［11］LI Xingtai，ZHANG Yakui，KUANG Haixue，et al.Mitochondrial protection and anti -aging activity of Astragalus polysaccharides and their potential mechanism［J］. International Journal of Molecular Sciences，2012，13(2):1747 -1761.

［12］LI Xingtai，ZHAO Jia. Cancer-preventive mechanism from the perspective of effects of the Astragalus polysaccharides on mitochondrial energy metabolism improvement［M］// Cancer – Cares，Treatments and Preventions. Brisbane:iConcept Press，2014:141 -180.

［13］王浩江，孫體健，曹曉峰. 月季花中總黃酮含量測(cè)定［J］. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(4):318 -319.

［14］DUBOIS M，GILLES K A，HAMILTON J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28(3):350 -356.

［15］FONTANA M，MOSCA L，ROSEI M A. Interaction of enkephalines with oxyradicals［J］. Biochemical Pharmacology，2001，61(10):1253 -1257.

［16］LIN Z，ZHU D，YAN Y，et al. An antioxidant phytotherapy to rescue neuronal oxidative stress［J］. Evidence- based Complementary and Alternative Medicine，2011，2011:519517:1 - 519517:7.

［17］ZHAO G R，XIANG Z J，YE T X，et al. Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng［J］. Food Chemistry，2006，99(4):767 -774.

［18］YONGXU S，JICHENG L. Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from the roots of Codonopsis pilosula and its immunity activity［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2008，43(3):279 -282.

［19］SUN Y X. Immunological adjuvant effect of a water -soluble polysaccharide，CPP，from the roots of Codonopsis pilosula on the immune responses to ovalbumin in mice［J］. Chemistry ＆ Biodiversity，2009，6(6):890-896.

［20］張冬青，汪德清. 黃芪總黃酮生物學(xué)活性作用研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)中藥雜志，2010，35(2):253 -256.

［21］張薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗. 黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)中藥雜志，2012，37(21):3203 -3207.

［22］KRIVORUCHKO A，STOREY K B. Forever young:mechanisms of natural anoxia tolerance and potential links to longevity［J］. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2010，3(3):186 -198.

［23］ST -PIERRE J，BUCKINGHAM J A，ROEBUCK S J，et al. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain［J］. Journal of Biological Chemistry，2002，277(47):44784-44790.

［24］VALKO M，LEIBFRITZ D，MONCOL J，et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］. The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2007，39(1):44 -84.

［25］SCHMEI ER S，RISTOW M，BIRRINGER M. Recent reassessment of the role of reactive oxygen species(ROS)［J］. Ernaehrungs Umschau International，2013，60(9):162 -167.

［26］LIU Ruihai. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals［J］. The American Journal of Clinical Nutrition，2003，78(3):517S-520S.