鄭翠萍,權(quán)美平,2,康莉娜,馬婷婷,趙 佩,田呈瑞,*

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062；2.渭南師范學(xué)院多河流濕地重點實驗室,陜西渭南 714000)

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茜草丙酮提取物抑菌活性及機(jī)制的研究

鄭翠萍1,權(quán)美平1,2,康莉娜1,馬婷婷1,趙 佩1,田呈瑞1,*

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062；2.渭南師范學(xué)院多河流濕地重點實驗室,陜西渭南 714000)

目的:對茜草丙酮提取物的抑菌活性及機(jī)理進(jìn)行研究,為茜草資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法:用濾紙片法和刃天青指示劑法測定抑菌圈和MIC、MBC研究抑菌活性,并進(jìn)一步通過生長曲線的繪制,電導(dǎo)率值的變化和細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的測定研究提取物的抑菌機(jī)理。結(jié)果:通過抑菌圈、最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定,發(fā)現(xiàn)茜草提取物對枯草芽孢桿菌抑菌作用最強(qiáng),其次是表面葡萄球菌,最差是蠟樣芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌的生長曲線,菌液電導(dǎo)率及其細(xì)胞內(nèi)容物的變化趨勢檢測結(jié)果表明:抑菌機(jī)理可能源于抑制細(xì)菌的對數(shù)生長期分裂速度,導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性的增加和細(xì)胞內(nèi)容物的外漏。本研究結(jié)果表明:茜草丙酮提取物作為天然抗菌劑有很大的應(yīng)用潛力。

茜草,丙酮提取物,抑菌活性,抑菌機(jī)理

茜草(RubiaCordifoliaL.)為茜草科茜草屬植物,別名破血丹、粘粘草、拉拉藤、血見愁、小活血和活血草等。在我國主要分布于陜西、江蘇、安徽、河南、山東[1],藥用茜草以陜西、山西和河南為主產(chǎn)區(qū),且藥效最好[2]。茜草為中國傳統(tǒng)常用中藥之一,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,名“茜根”[3]。藥用其干燥根及根莖,有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)等功效[4]。

茜草中主要含有水溶性的環(huán)已肽類系列物質(zhì),脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷,此外還含有萜類、β谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素等成分[5-6],具有廣泛的生理活性,經(jīng)常作為染色劑添加于食品當(dāng)中。對于茜草抑菌活性的研究,許多學(xué)者的研究結(jié)果表明[7-9],茜草根水提液在體外對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感桿菌和部分皮膚真菌等均有一定的抑制作用[7]；于相麗等[8]研究了茜草根不同部位提取物的抑菌效果,結(jié)果表明基部根效果最好；劉艷娟等[9]對茜草不同極性有機(jī)層提取物的體外抑菌活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)茜草具有抑菌活性,特別是甲醇層提取物和丙酮層提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性。但有關(guān)茜草的抑菌機(jī)制方面尚無研究。本文系統(tǒng)地對茜草丙酮提取物的抑菌活性和抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究,以為茜草的傳統(tǒng)藥用價值以及后續(xù)研究建立科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮采茜草根 室溫陰干,粉碎過40目篩備用；丙酮、NaOH、刃天青、PBS、葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)、DNS、二甲基亞砜(DMSO)、瓊脂、營養(yǎng)肉湯、牛肉膏、蛋白胨等 均為分析純試劑；慶大霉素(8萬單位) 鄭州卓峰制藥廠；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[10]牛肉膏,蛋白胨,瓊脂,NaCl(NaOH調(diào)pH7.2～7.4)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escheichiacoli)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、表面葡萄球菌(Staphepidermidis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi) 由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供,將各種細(xì)菌分別用斜面培養(yǎng)法進(jìn)行活化,活化后挑取適量菌苔用無菌水配制成107cfu/mL和108cfu/mL的菌懸液備用。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52) 上海安亭實驗儀器有限公司；恒溫振蕩器(SHA-C) 金壇市富華儀器有限公司；凈化工作臺(S.SW-CJ-1F) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KB) 上海申安醫(yī)療器械廠；全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Go) 美國熱電公司；紫外可見分光光度計(TU-1810) 上海光譜儀器有限公司；電導(dǎo)率儀(DDS-307) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；分析天平(AL204) 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丙酮提取物的制備 以丙酮為溶劑,精確稱取處理后的茜草粉50.0000g,料液比1∶10添加,40℃恒溫振蕩器中24h震蕩提取后,真空抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),烘箱內(nèi)加熱濃縮后成浸膏狀,最終用二甲基亞砜配成10mg/mL樣品備用。茜草丙酮的最終提取物得率為2.67%。

1.2.2 抑菌活性和抑菌機(jī)制的測定

1.2.2.1 菌株敏感性即抑菌圈(DIZ)的檢測 在無菌條件下,用已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板,待冷卻凝固后,分別加入0.1mL的107cfu/mL的菌懸液,用無菌涂布器涂布均勻,于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)10～15min至培養(yǎng)基表面干燥后,用無菌鑷子夾取直徑為6mm的圓形滅菌(121℃,30min)濾紙片貼于含菌平板上,每個平板貼3片,移取10μL提取物(8mg/mL)加在濾紙片上,以慶大霉素(4mg/mL)作為陽性對照,二甲基亞砜(DMSO)作為陰性對照。于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后,取出平板,采用十字交叉法測量各紙片周圍抑菌圈直徑。

1.2.2.2 茜草提取物最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測定 取5mL的107cfu/mL濃度的菌液和7.5mL的刃天青指示劑貯備液(0.07g/100mL[11])混勻,將混勻的菌液取100μL加入到96孔板中,無菌對照組不加。取最大濃度10mg/mL的樣品,采用對半稀釋法稀釋后濃度最終為10、5.0、2.5、1.25、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL,各取10μL加入96孔板中,每孔均加入100μL的液體培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng),每5～6h觀測一次,有細(xì)菌生長的孔會逐漸由藍(lán)色變粉色,其中無菌對照孔為藍(lán)色,細(xì)菌正常(不添加樣品)孔為亮紅色,以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度(MIC)。MIC確定后,吸取所有未變色濃度的樣品5μL,加入到100μL培養(yǎng)基與刃天青指示劑貯備液中,同樣的條件培養(yǎng)24h,仍舊不見顏色變化的孔中,即為最小殺菌濃度(MBC)[11-12]。同時,以DMSO作為陰性對照,以慶大霉素作為陽性對照,所有處理都重復(fù)三次。

1.2.2.3 茜草提取物對細(xì)菌生長曲線的影響 以MIC為基礎(chǔ)配制含藥液體培養(yǎng)基,設(shè)置空白組和實驗組。取10μL培養(yǎng)至對數(shù)期、濃度108cfu/mL的供試菌液接種于含200μL液體培養(yǎng)基的96孔板中,每個菌種接三孔,其中兩管分別加入20μL的1×MIC、2×MIC濃度的提取液,另一管加等量無菌水作為對照。于37℃水浴震蕩培養(yǎng),分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、24h時測定于600nm吸光值,并繪制微生物的生長曲線,每組處理重復(fù)三次。

1.2.2.5 茜草提取物對細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響 菌體活化后用PBS清洗三次,混勻。將混勻的菌懸液分成3等份,再加入不同濃度的樣液,使樣液在菌懸液中的終濃度分別為1×MIC、2×MIC、0(0即為空白對照,加入無菌水即可)?；靹蚝?立即取8mL,5000r/min離心15min,取上清液待用。菌懸液置于37℃,120r/min的環(huán)境中,之后每隔2h取一次樣,離心。取離心后的上清液0.3mL,紫外可見分光光度計260nm下測定吸光值(PBS調(diào)零)。再取離心后的上清液0.5mL,加入5mL的考馬斯亮藍(lán)試劑,5min后,調(diào)分光光度計波長至595nm處,以0.5mL蒸餾水+5mL的考馬斯亮藍(lán)試劑管為調(diào)零點,測樣品管的吸光值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品的蛋白質(zhì)含量。最后取處理好的上清液0.5mL,加入1.5mL的蒸餾水,再加入1.5mL DNS,搖勻,在沸水浴中準(zhǔn)確加熱10min,取出,用冷水迅速冷卻至室溫,調(diào)分光光度計波長至540nm,以2mL 蒸餾水+1.5mL DNS管為調(diào)零點,測定OD值[13],通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品的還原糖含量。以上處理均重復(fù)三次。

表1 茜草提取物對受試菌的DIZ、MIC和MBC測定結(jié)果Table1 DIZ,MIC and MBC of the extract from Rubia Cordifolia

注:-表示未檢出。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析,數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈的測定結(jié)果

表1表明,茜草的丙酮提取物對金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌和大腸桿菌具有不同程度的抑制作用。其中,革蘭氏陽性菌中枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為(19.85±0.11)mm,表面葡萄球菌為(14.13±0.31)mm,金黃色葡萄球菌為(13.48±0.18)mm,蠟狀芽孢桿菌為(11.57±0.75)mm；革蘭氏陰性菌中痢疾桿菌為(12.07±0.61)mm,傷寒沙門氏菌為(10.53±0.48)mm,大腸桿菌僅為(9.80±0.39)mm,而作為陽性對照的慶大霉素對測試的7種微生物都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,作為陰性對照的二甲基亞砜(DMSO)沒有表現(xiàn)出任何抑菌作用,表明其作為精油的溶劑不會影響抑菌實驗的結(jié)果。從表1明顯看出,茜草丙酮提取物對陽性菌的抑制作用強(qiáng)于陰性菌,這和Nikaido等人的研究結(jié)果相似[14]。Nikaido和Wendakoon等人研究表明,革蘭氏陰性菌與陽性菌相比具有不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁,獨特的外膜結(jié)構(gòu),對于抑菌物質(zhì)具有一定的抵抗作用[14-15]。但是,Chunyan Gao,Kim等人研究指出多個因素影響抑菌物質(zhì)的活性,不同種類的抑菌物質(zhì)對于不同的細(xì)菌具有不同的抑菌作用[16-17]。所以,需要我們對于抑菌機(jī)理進(jìn)行深入的研究。

茜草提取物對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為0.125mg/mL、最小殺菌濃度是0.25mg/mL,抑菌效果最好,其次是表面葡萄球菌的最小抑菌濃度是0.25mg/mL、最小殺菌濃度是0.5mg/mL,抑菌效果最差的是蠟樣芽孢桿菌,最小抑菌濃度為10mg/mL,因為丙酮提取物的最大濃度是10mg/mL,所以最大殺菌濃度無法測定。由表1綜合可得,茜草丙酮提取物對枯草芽孢桿菌抑菌效果最好。

2.2 茜草的丙酮提取物對菌體生長曲線的影響

由圖1可以看出,枯草芽孢桿菌的正常組經(jīng)過短暫的延滯期后迅速進(jìn)入快速生長的對數(shù)期,OD值顯著增高,而加入茜草提取物的1×MIC和2×MIC組OD值稍有增長,但漲幅較小,表明茜草提取物抑菌效果很好。同時可以得出茜草提取物的抑菌作用主要表現(xiàn)在生長對數(shù)期,通過抑制細(xì)菌的分裂速度,延緩其對數(shù)期,降低細(xì)菌總數(shù),從而有效控制菌體數(shù)量的增加[18]。

圖1 枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of B. subtilis

2.3 茜草提取物對菌液電導(dǎo)率的影響

由圖2得出,隨著抑菌物質(zhì)作用時間的延長,菌液電導(dǎo)率呈上升趨勢。其中生長控制組在前4h相對電導(dǎo)率基本沒有變化,隨后因為細(xì)菌的正常死亡導(dǎo)致細(xì)胞溶解,相對電導(dǎo)率小幅度上升。與控制組相比,加入茜草萃取物的兩組隨著培養(yǎng)時間的延長,相對電導(dǎo)率均有大幅度增長,而且2×MIC組的相對電導(dǎo)率值明顯增長幅度大于1×MIC組。菌液電導(dǎo)率的改變,反映細(xì)胞膜滲透性的變化,加入茜草提取物,菌液的電導(dǎo)率增加,表明茜草提取物可使菌體細(xì)胞膜的通透性增加,使菌體細(xì)胞質(zhì)滲漏到了細(xì)胞外[19]。原因可能是茜草提取物誘導(dǎo)產(chǎn)生了某些降解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶所致[20]。

圖2 茜草提取物對枯草芽孢桿菌菌液電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of the extract from Rubia Cordifolia. on the impermeability of cell membrane of tested B. subtilis.

2.4 茜草提取物對細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響

細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的檢測指標(biāo)有菌懸液的上清液在260nm測定的吸光值、上清液中的蛋白質(zhì)和還原糖的含量。表2所示枯草芽孢桿菌被不同濃度的茜草提取液處理4h后測定的結(jié)果。結(jié)果顯示:細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏量與控制組相比,隨著茜草提取物的添加量的增加而顯著性增加(p<0.05)。1×MIC組的細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的OD值從0.035增加到0.869(p<0.05),2×MIC組的細(xì)胞內(nèi)容物滲漏從0.035增加到1.043(p<0.05),原因是枯草芽孢桿菌的胞內(nèi)物質(zhì)外泄。由此得出,細(xì)胞膜的通透性增加[13],甚至細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物比如蛋白質(zhì)、還原性糖等細(xì)胞的主要成分釋放到胞外[21]。

表2 茜草提取物對細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響Table2 The effect of the of the extracton cell constituents’ release of tested B. subtilis

注:在同一列中不同的小寫字母表示兩兩數(shù)據(jù)之間差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

本研究測定了茜草提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈、MIC和MBC,并以MIC為基礎(chǔ),研究了茜草提取物對枯草芽孢桿菌的生長曲線,菌液電導(dǎo)率變化和細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響。結(jié)果表明,茜草提取物對枯草芽孢桿菌抑菌效果最好,其次是表面葡萄球菌,最差的是蠟樣芽孢桿菌,茜草抑菌物質(zhì)主要影響細(xì)菌生長曲線的對數(shù)生長期,有效抑制細(xì)菌的增長。通過對電導(dǎo)率變化和細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的測定,推測其抑菌機(jī)理可能是茜草提取物誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生降解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶,提高了膜的通透性,致使胞內(nèi)物質(zhì)外泄,菌體不能正常生長繁殖,從而達(dá)到抑菌作用。

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Study on the antibacterial activity and its mechanism of acetone extract fromRubiaCordifolia

ZHENG Cui-ping1,QUAN Mei-ping1，2,KANG Li-na1,MA Ting-ting1,ZHAO Pei1,TIAN Cheng-rui1,*

(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’ an 710062,China；2.Key Lab of Wet Land Ecology and Environment of Duoheliu of Shaanxi Province,Weinan 714000,China)

Objective:The antibacterial activity and its mechanism were investigated on acetone extracts from theRubiaCordifoliato provide a scientific basis for development and utilization of therubiacordifoliaresources. Method:The antibacterial activities were evaluated by using the filter method and resazurin indicator method to measure the inhibition zone,MIC and MBC. The antibacterial mechanisms were studied by drawing growth curve,the change of conductivity and leakage of cellular contents. Result:The results showed that the sensitivities to the extract were different for different tested bacteria. The antibacterial activity of the extract was particularly strongest against B subtilis,and was weakest against B. Cereus. The following test results including growth curve of B subtilis and its variation trend of liquid conductivity and the cell contents showed that antibacterial mechanism may due to inhibit split speed of bacterial exponential phase and result in the increase in permeability of cell membranes and the leakage of intracellular constituents on the basis of the cell constituents’ release assay. The data of this study suggested that the extract fromRubiaCordifoliahad great potential for application as a natural antimicrobial agent.

RubiaCordifol;acetone extract;antibacterial activity;antibacterial mechanism

2014-06-24

鄭翠萍(1989-),女,在讀碩士,研究方向:植物新資源開發(fā)利用。

*通訊作者:田呈瑞(1955-),男,博士，教授,研究方向:植物新資源開發(fā)利用。

陜西省2013年軍民融合研究基金項目(13JMR21)。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0116-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.016